| Combining Gel Retardation and Footprinting to Determine Protein-DNA Interactions of Specific and/or Less Stable Complexes
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] DNA footprinting is a classic technique to investigate protein-DNA interactions. However, traditional footprinting protocols can be unsuccessful or difficult to interpret if the binding of the protein to the DNA is weak, the protein has a fast off-rate, or if several different protein-DNA complexes are formed. Our protocol differs from traditional footprinting protocols, because it provides a method to isolate the protein-DNA complex from a native gel after treatment with the footprinting agent, thus removing the bound DNA from the free DNA or other protein-DNA complexes. The DNA is then extracted from the isolated complex before electrophoresis on a sequencing gel to determine the footprinting pattern. This analysis provides a possible solution for those who have been unable to use ...
[摘要] [摘要] DNA足迹是研究蛋白质-DNA相互作用的经典技术。但是，如果蛋白质与DNA的结合较弱，蛋白质的脱落速率较快，或者形成了几种不同的蛋白质-DNA复合物，则传统的足迹方案可能会失败或难以解释。我们的协议不同于传统的足迹协议，因为它提供了一种在使用足迹剂处理后从天然凝胶中分离蛋白质-DNA复合物的方法，从而从游离DNA或其他蛋白质-DNA复合物中去除了结合的DNA。然后从分离的复合物中提取DNA，然后在测序凝胶上电泳以确定印迹模式。该分析为无法使用传统足迹法确定蛋白质与DNA接触的人提供了可能的解决方案。
[背景]核酸酶/化学足迹是一个典型的方法来探测蛋白质-DNA相互作用（腊士和施米茨，1978;萨瑟-德怀特和Gralla，1989;汉普等人，2007） ...
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| Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within nine days.
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里，我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒，允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在，所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复（CRISPR）突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作，因为它允许两个等位基因同时突变（Vyas et al。，2015; Min et al。，2016; Ng and Dean，2017 ）。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序（PAM）的互补靶位点（Jinek等人，2012; Cong等人， 2013年;马里等人，2013年）。 CRISPR相关（Cas）核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA（tracrRNA）相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向（Gasiunas等人， ...
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| Metal-tagging Transmission Electron Microscopy for Localisation of Tombusvirus Replication Compartments in Yeast
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Positive-stranded (+) RNA viruses are intracellular pathogens in humans, animals and plants. To build viral replicase complexes (VRCs) viruses manipulate lipid flows and reorganize subcellular membranes. Redesigned membranes concentrate viral and host factors and create an environment that facilitates the formation of VRCs within replication organelles. Therefore, efficient virus replication depends on the assembly of specialized membranes where viral macromolecular complexes are turned on and hold a variety of functions. Detailed characterization of viral replication platforms in cells requires sophisticated imaging approaches. Here we present a protocol to visualize the three-dimensional organization of the tombusvirus replicase complex in yeast with MEtal-Tagging Transmission Electron ...
[摘要] 正链（+）RNA病毒是人，动物和植物中的细胞内病原体。构建病毒复制酶复合物（VRC）病毒操纵脂质流动和重组亚细胞膜。重新设计的膜集中了病毒和宿主因子，并创造了促进复制细胞器内VRC形成的环境。因此，有效的病毒复制取决于病毒大分子复合物开启并具有各种功能的特殊膜的组装。细胞中病毒复制平台的详细特征需要复杂的成像方法。在这里我们提出一个协议，用肉眼标记透射电子显微镜（METTEM）可视化酵母中的tombusvirus复制酶复合物的三维组织。该协议使我们能够用METTEM和电子断层扫描成像三维病毒复制酶分子的细胞内分布。我们的研究显示病毒复制酶分子如何在特化细胞膜内构建复制复合物。
【背景】正链RNA病毒的复制取决于细胞膜的重塑。细胞内膜作为VRC装配的结构支架，提供调节病毒复制酶活性和保护病毒RNA免受宿主抗病毒防御的必需脂质和辅因子（Miller和Krijnse-Locker，2008; den Boon <等，2010; nagy和pogany，2011;="" nagy，2016）。电子显微镜观察到具有活性vrc的复制细胞器的结构。="" vrc以单个膜囊或'小球'，管状球形立方体膜，双膜囊泡（dmv）或平面寡聚体阵列装配（de="" castro等人，2013）。通常在rna病毒感染的细胞中观察到小球。它们通过在各种细胞器中内陷而形成，并具有对胞质溶胶的狭窄开口（den="" boon="" et=""> ...
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