| Uptake Assays in Xenopus laevis Oocytes Using Liquid Chromatography-mass Spectrometry to Detect Transport Activity
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Xenopus laevis oocytes are a widely used model system for characterization of heterologously expressed secondary active transporters. Historically, researchers have relied on detecting transport activity by measuring accumulation of radiolabeled substrates by scintillation counting or of fluorescently labelled substrates by spectrofluorometric quantification. These techniques are, however, limited to substrates that are available as radiolabeled isotopes or to when the substrate is fluorescent. This prompted us to develop a transport assay where we could in principle detect transport activity for any organic metabolite regardless of its availability as radiolabeled isotope or fluorescence properties.
In this protocol we describe the use of X. laevis oocytes ...
[摘要] 非洲爪蟾卵母细胞是用于表征异源表达的第二活性转运蛋白的广泛使用的模型系统。历史上，研究人员依靠通过闪烁计数或荧光标记的底物通过分光荧光定量测量放射性标记底物的积累来检测运输活动。然而，这些技术仅限于可用作放射性标记的同位素的底物或当底物是荧光时。这促使我们开发了一种运输测定法，我们可以原则上检测任何有机代谢物的转运活性，无论其作为放射性标记的同位素或荧光性质如何。
在这个协议中，我们描述了X的使用。卵母细胞作为表达次要活性转运蛋白的异源宿主，以及如何进行摄取测定，然后通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）检测和定量运输的代谢物。我们已经成功地使用这种方法来鉴定和表征称为硫代葡萄糖苷和氰基葡糖苷的植物防御代谢物的转运蛋白（Jørgensen等人，2017），然而该方法可用于表征任何转运蛋白底物可以通过LC-MS检测。
【背景】来自非洲爪蟾蛙（Xenopus laevis）的卵母细胞是用于异源表达和表征膜蛋白（即，转运蛋白和通道）的完整表达系统。 X。卵母细胞表达少量内源性膜蛋白，具有低的背景转运活性。此外，来自植物的次要活性转运蛋白（Boorer等人，1992; Theodoulou和Miller，1995; Nour-Eldin等人，2006），动物（Sumikawa 1981）; ...
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| Separation and Purification of Glycosaminoglycans (GAGs) from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The nematode Caenorhabditis elegans is a popular model organism for studies of developmental biology, neurology, ageing and other fields of basic research. Because many developmental processes are regulated by glycosaminoglyans (GAGs) on cell surfaces and in the extracellular matrix, methods to isolate and analyze C. elegans GAGs are needed. Such methods have previously been optimized for other species such as mice and zebrafish. After modifying existing purification protocols, we could recently show that the nematodes also produce chondroitin sulfate, in addition to heparan sulfate, thus challenging the view that only non-sulfated chondroitin was synthesized by C. elegans. We here present our protocol adapted for C. elegans. Since the purification ...
[摘要] 线虫秀丽隐杆线虫是研究发育生物学，神经学，衰老等基础研究领域的流行模型生物。 因为许多发育过程由细胞表面和细胞外基质中的糖胺聚糖（GAG）调节，分离和分析C的方法。 线虫需要GAG。 此类方法先前已针对其他物种如小鼠和斑马鱼进行了优化。 在修改现有的纯化方案后，我们最近可以显示除了硫酸乙酰肝素外，线虫也产生硫酸软骨素，因此挑战了仅通过C合成非硫酸软骨素的观点。线虫。 我们在这里介绍我们适用于C的协议。线虫。 由于净化策略涉及非硫酸化和硫酸化GAG的分离，所以对于其他可能有利的方法也是有用的。
【背景】糖胺聚糖（GAG）是重复二糖单元的直链多糖链，其通常被硫酸根取代。除了透明质酸，其是在质膜上合成而不被锚定到任何蛋白质的非硫酸化GAG，所有其他GAG都与核心蛋白共价连接，从而形成蛋白聚糖（PG）。在PG上发现的最常见的GAG是硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素，含有N-乙酰基 - 葡糖胺和N，N-乙酰基 - 半乳糖胺，分别（张，2010）。在高尔基隔室的生物合成过程中，它们是非模板驱动的过程，它们经过多种修饰，包括将葡萄糖醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸，并在不同位置硫酸化（Bulow和Hobert，2006; ...
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| Determination of the Predatory Capability of Bdellovibrio bacteriovorus HD100
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Bdellovibrio bacteriovorus HD100 is an obligate predator that preys upon a wide variety of Gram negative bacteria. The biphasic growth cycle of Bdellovibrio includes a free-swimming attack phase and an intraperiplasmic growth phase, where the predator replicates its DNA and grows using the prey as a source of nutrients, finally dividing into individual cells (Sockett, 2009). Due to its obligatory predatory lifestyle, manipulation of Bdellovibrio requires two-member culturing techniques using selected prey microorganisms (Lambert et al., 2003). In this protocol, we describe a detailed workflow to grow and quantify B. bacteriovorus HD100 and its predatory ability, to easily carry out these laborious and time-consuming techniques.
[摘要] HDD是一种专有捕食者，可以用于各种革兰氏阴性菌。 Bdellovibrio的双相生长周期包括自由游泳攻击阶段和胞内生长期，其中捕食者复制其DNA并使用猎物作为营养源，最终分成单个细胞（Sockett ，2009）。由于其必要的掠夺性生活方式，使用选择的猎物微生物（Lambert等人，2003）的双重培养技术的操作需要Bdellovibrio 。在这个协议中，我们描述了一个详细的工作流程来增长和量化。细菌性HD100及其掠夺能力，轻松实施这些费时费力的技术。
在过去几年中，Bdellovibrio 已经吸引了科学界的兴趣，并且已经开发了若干应用，如进化研究（Davidov和Jurkevitch，2009），鉴定新的生物催化剂（Martínezet al。 （2012）），治疗应用（Atterbury等人，2011），或使用Bdellovibrio的生物技术应用作为回收附加值的溶解剂细胞内生物产物（Martínez等人，2016）。由于对Bdellovibrio 的兴趣日益增加，已经开发了用于量化这种掠食性细菌的不同间接方法（Mahmoud等人，2007; Lambert和Sockett，2008; Van Essche et al。，2009）。然而，通过双层方法直接量化B。o is is is is is is is is is to to to to ...
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