| CRISPR/Cas9 Gene Editing in the Marine Diatom Phaeodactylum tricornutum
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The establishment of the CRISPR/Cas9 technology in diatoms (Hopes et al., 2016; Nymark et al., 2016) enables a simple, inexpensive and effective way of introducing targeted alterations in the genomic DNA of this highly important group of eukaryotic phytoplankton. Diatoms are of interest as model microorganisms in a variety of areas ranging from oceanography to materials science, in nano- and environmental biotechnology, and are presently being investigated as a source of renewable carbon-neutral fuel and chemicals. Here we present a detailed protocol of how to perform CRISPR/Cas9 gene editing of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum, including: 1) insertion of guide RNA target site in the diatom optimized CRISPR/Cas9 vector (pKS diaCas9-sgRNA), 2) ...
[摘要] 在硅藻（Hopes ，2016; Nymark等人，2016）中建立了CRISPR / Cas9技术，使得能够简单，廉价和有效地引入目标 这个非常重要的真核浮游植物群的基因组DNA的改变。 硅藻在纳米和环境生物技术领域从海洋学到材料科学，各种领域的示范性微生物都是有意义的，目前正在作为可再生碳中和燃料和化学品的来源进行调查。 在这里，我们提出了如何进行海洋硅藻三角褐指藻CRISPR / Cas9基因编辑的详细方案，包括：1）在硅藻优化的CRISPR / Cas9载体（pKS diaCas9）中插入引导RNA靶位点 -sgRNA），2）用于将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入P的生物弹道转化。 三分支毛细胞和3）基于高分辨率熔融的PCR测定以筛选CRISPR / Cas9诱导的突变。
【背景】CRISPR / Cas9系统已被证明是许多真核生物中非常有效和成功的基因组编辑系统，现在也包括微藻（Hopes等人，2016; Nymark等人）。 ，2016; Shin 等人，2016）。 CRISPR / Cas9系统包括引导RNA（gRNA）和称为Cas9的核酸酶（Sander and Joung，2014）。 这两个分子形成复合物，其中gRNA将复合物引导至感兴趣的靶标。 ...
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| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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| In vivo Bioluminescence Imaging of Luciferase-labeled Cancer Cells
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Author:
Date:
2016-03-20
[Abstract] Over the past decade, in vivo bioluminescent imaging has emerged as a non-invasive and sensitive tool for studying ongoing biological processes within living organisms (Contag et al., 1997; Contag et al., 1998). Based on the detection and quantitation of the photons produced by the oxidation of luciferin by luciferase enzymes (Harvey, 1927), this technique has proved to be particularly useful in analyzing cancerous cells and monitoring tumor growth (Edinger et al., 1999; Sweeney et al., 1999; Vidal et al., 2015), providing a cost-effective insight into how the disease progresses in vivo, without the need of serial sacrifice of animals. This protocol describes in detail the procedure of obtaining luciferase-tagged tumors in ...
[摘要] 在过去十年中，体内生物发光成像已经成为用于研究活生物体内正在进行的生物过程的非侵入性和敏感性工具（Contag等人，1997; Contag et al。，1998）。 基于通过荧光素酶氧化荧光素产生的光子的检测和定量（Harvey，1927），该技术已经证明在分析癌细胞和监测肿瘤生长中特别有用（Edinger等， ，1999; Sweeney等人，1999; Vidal等人，2015），提供了关于疾病在体内如何进展的成本效益的洞察 ，无需连续牺牲动物。 该协议详细描述了在免疫受损的小鼠中获得荧光素酶标记的肿瘤的程序，其可以通过使用IVIS光谱成像仪通过生物发光成像进行研究。
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