| Production of Guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR Using Ribozymes and RNA Polymerase II Promoters
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Author:
Date:
2017-02-20
[Abstract] CRISPR/Cas9-mediated genome editing relies on a guide RNA (gRNA) molecule to generate sequence-specific DNA cleavage, which is a prerequisite for gene editing. Here we establish a method that enables production of gRNAs from any promoters, in any organisms, and in vitro (Gao and Zhao, 2014). This method also makes it feasible to conduct tissue/cell specific gene editing.
[摘要] CRISPR / Cas9介导的基因组编辑依赖于指导性RNA（gRNA）分子来产生序列特异性DNA切割，这是基因编辑的前提条件。在这里，我们建立了一种能够从任何启动子，任何生物体内和体外生产gRNA的方法（Gao和Zhao，2014）。该方法也可以进行组织/细胞特异性基因编辑。
背景 几乎所有报道的CRISPR介导的基因编辑病例都使用小核RNA如U6和U3 snRNA启动子的启动子来驱动体内生产gRNAs（Cong等人，2013; Mali等人，2013）。然而，U6和U3启动子有几个主要的局限性：1）它们是组成型活性的，不可调谐的; 2）它们缺乏细胞/组织特异性; 3）它们在许多生物体中没有明确定义; 4）U6需要G和U3需要A用于转录起始，从而限制目标选择; 5）由于缺乏商业RNA聚合酶III，它们不适合体外转录。不幸的是，构成大部分特征启动子的RNA聚合酶II启动子不能直接用于体内的gRNA生产，原因如下：1）RNA聚合酶II启动子的主要转录物经历广泛的加工如5'-端封端，3'末端聚腺苷酸化和拼接出内含子。一些修饰可能使设计的gRNA无功能。 2）将成熟的RNA分子转运到细胞质中;因此它们与位于细胞核中的预期目标物理分离。这就是为什么使用U6和U3 ...
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| In vitro Reconstitution Assay of miRNA Biogenesis by Arabidopsis DCL1
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Author:
Date:
2015-04-20
[Abstract] microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs, regulating most if not all, biological processes in eukaryotic organisms. miRNAs are initially processed from primary transcripts (pri-miRNAs) to produce miRNA precursors (pre-miRNAs), that are further processed into miRNA and its complementary strands (miRNA/*). In Arabidopsis, and possibly other plants, the processing from pri-miRNAs to pre-miRNAs and from pre-miRNAs to miRNA/* are both implemented through Dicer-like 1 (DCL1) complexes. Recently, we demonstrated isolation of DCL1 complexes of unprecedented quality from in planta. We further successfully reconstituted DCL1 cleavage assays in vitro that were able to fully recapitulate in vivo miRNA biogenesis. Here we provide a detailed protocol of DCL1 ...
[摘要] 微小RNA（miRNA）是小的非编码RNA，其调节真核生物中的大多数（如果不是全部）生物过程。 miRNA最初从初级转录物（pri-miRNA）加工以产生miRNA前体（前-miRNA），其进一步加工成miRNA及其互补链（miRNA/*）。在拟南芥和可能的其他植物中，从pri-miRNA到pre-miRNA和从pre-miRNA到miRNA/*的加工都通过Dicer样1（DCL1）复合物实现。最近，我们证明了从植物中以前的质量的DCL1复合物的分离。我们进一步成功地重建了能够完全重现体内 miRNA生物发生的DCL1切割测定。在这里我们提供DCL1重建测定的详细协议。该方案包括三个主要部分（图1）：1）pri-miRNA和pre-miRNA转录物的制备（方法A-C）; 2）通过免疫沉淀（IP）纯化来自本塞姆氏烟草（本塞姆氏烟草）的重组拟南芥DCL1机器（程序D和E）;和3）使用分离的DCL1复合物（步骤F）在放射性同位素标记的pri-miRNA或pre-miRNA的体外处理。这是我们的愿望，协议是RNAi社区研究机械问题或开发RNA沉默技术的强大工具。
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| Cross-linked RNA Immunoprecipitation
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Author:
Date:
2013-03-05
[Abstract] This method is for the immunoprecipitation of Flag-Tagged RNA binding proteins from mammalian cell lines and isolation of the bound RNAs for analysis by quantitative real-time PCR. The RNA binding protein of interest should be tagged with the M2 Flag-tag and expressed in the mammalian cell line of interest (Knuckles et al., 2012). However, specific antibodies for the protein of interest can be used in conjunction with Sepharose G-beads.
[摘要] 该方法用于来自哺乳动物细胞系的Flag-标记的RNA结合蛋白的免疫沉淀和分离结合的RNA，用于通过定量实时PCR分析。 感兴趣的RNA结合蛋白应该用M2 Flag标签标记并在感兴趣的哺乳动物细胞系中表达（Knuckles等人，2012）。 然而，感兴趣的蛋白质的特异性抗体可以与Sepharose G-珠结合使用。
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