Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
|
Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the protein has a tag of six histidines at its amino terminal end. The purified protein possesses a native-like conformation and it is produced in large quantities, around 5-6 mg per liter.
[摘要] 在该协议中,我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白(氨基酸384-661)的胞外域的产生和纯化,其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达,但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中,我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化,因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象,并且大量生产,每升约5-6mg。 【背景】丙型肝炎病毒(HCV)是全世界慢性肝炎,肝硬化和肝细胞癌的主要原因(Major et al。,2001; Alter,2006)。此时,没有HCV疫苗,抗病毒药物用于治疗HCV感染(Imran et al。,2014)。然而,治疗费用昂贵且不是100%有效(Kohli et al。,2014)。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用,因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集,先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质,并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子(Flint ...
|
|
Separation of Thylakoid Protein Complexes with Two-dimensional Native-PAGE
|
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The hierarchical composition and interactions of the labile thylakoid protein complexes can be assessed by sequential 2D-native gel-electrophoresis system. Mild non-ionic detergent digitonin is used to solubilize labile protein super-and megacomplexes, which are then separated with first-dimension blue native polyacrylamide gel electrophoresis (1D-BN-PAGE). The digitonin derived protein complexes are further solubilized with stronger detergent, β-DM, and subsequently separated on an orthogonal 2D-BN-PAGE to release smaller protein subcomplexes from the higher-order supercomplexes. Here we describe a detailed method for 2D-BN-PAGE analysis of thylakoid protein complexes from Arabidopsis thaliana.
[摘要] 不稳定的类囊体蛋白复合物的分级组成和相互作用可以通过连续的2D天然凝胶电泳系统来评估。 温和的非离子洗涤剂洋地黄皂苷用于溶解不稳定的蛋白质超级和巨型复合物,然后用第一维蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-BN-PAGE)分离。 将洋地黄皂苷衍生的蛋白质复合物用更强的去污剂β-DM进一步溶解,随后在正交的2D-BN-PAGE上分离,以从较高级的超复合物中释放较小的蛋白质亚复合物。 在这里,我们描述了来自拟南芥的类囊体蛋白复合物的2D-BN-PAGE分析的详细方法。
【背景】在类囊体膜中发生光合作用的光反应,在高等植物中,由贴壁的grana类囊体和非贴壁的基质类囊体组成。光反应由多亚基蛋白复合物光系统(PS)I和II,细胞色素b 6 f和ATP酶催化。 PSII及其光捕获天线复合物(LHCII)在grana-thylakoids中最为丰富,因此在空间上与基质类囊体定位的PSI-LHCI复合物隔离(Andersson和Anderson,1980)。格拉纳和基质类囊体之间的间期在两个光系统中都得到了丰富(Albertsson,2001; Suorsa et al。,2015)。通过光依赖性LHCII和PSII蛋白的可逆磷酸化介导,光系统与LHCII一起组装成更大的超级和超级复合物。 ...
|
|
Crude Preparation of Lipopolysaccharide from Helicobacter pylori for Silver Staining and Western Blot
|
Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This protocol provides an easy and rapid method to prepare lipopolysaccharide from the gastric pathogen Helicobacter pylori for visualization on acrylamide gels by silver staining and for detecting the presence of Lewis antigens by Western blot. The silver staining is a four-step procedure, involving a 20 min-oxidation step, a 10 min-silver staining step, a 2-10 min color development step and finally a 1-min color termination step. Lipopolysaccharide from H. pylori wild-type and corresponding mutants analyzed by this method are described in a recent publication (Li et al., 2017). This crude preparation of LPS for silver staining is also applicable in other Gram-negative bacteria.
[摘要] 该方案提供了一种从胃病原幽门螺杆菌制备脂多糖的简便快速方法,用于通过银染显示丙烯酰胺凝胶,并通过Western印迹检测Lewis抗原的存在。 银染是四步法,包括20分钟氧化步骤,10分钟银染色步骤,2-10分钟显色步骤,最后是1分钟颜色终止步骤。 来自H的脂多糖。 在最近的出版物(Li等人,2017)中描述了通过该方法分析的野生型和相应的突变体的幽门螺杆菌。 这种用于银染的LPS的粗制剂也适用于其他革兰氏阴性细菌。 【背景】脂多糖(LPS)是一种大而可变的复合糖脂,其组成了大多数革兰氏阴性细菌外膜的外叶。 它通常由三个结构域组成:称为脂质A(或内毒素)的疏水结构域,其嵌入外膜中; 相对保守的非重复核 - 低聚糖; 和从细胞延伸到外部环境的可变O-抗原。 H的独特功能。 幽门螺杆菌脂多糖O抗原是模拟人Lewis抗原的岩藻糖基化寡糖结构的存在。 从革兰氏阴性细菌大规模提取高纯度的LPS是劳动密集型和耗时的。 在这里,在这个协议中,我们详细地描述了使用来自胃病原幽门螺杆菌的容易和快速的粗制备制剂用于通过银染和Lewis抗原通过蛋白质印迹进行表达。
|
|