| An in vitro Co-culture System for the Activation of CD40 by Membrane-presented CD40 Ligand versus Soluble Agonist
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] One fundamental property of the TNR receptor (TNFR) family relates to how ‘signal quality’ (the extent of receptor ligation or cross-linking) influences the outcome of receptor ligation, for instance the induction of death in tumour cells. It is unequivocal that membrane-presented ligand (delivered to target cells via cell-surface presentation by co-culture with ligand-expressing third-party cells) induces a greater extent of carcinoma cell death in vitro in comparison to non-cross-linked agonists (agonistic antibodies and/or recombinant ligands). The CD40 receptor epitomises this fundamental property of TNF receptor-ligand interactions, as the extent of CD40 cross-linking dictates cell fate. Membrane-presented CD40 ligand (mCD40L), but not soluble agonists (e.g., ...
[摘要] TNR受体（TNFR）家族的一个基本特性涉及“信号质量”（受体连接或交联的程度）如何影响受体连接的结果，例如肿瘤细胞中的死亡诱导。毫无疑问，膜呈递配体（通过与表达配体的第三方细胞共培养通过细胞表面呈递递送至靶细胞）在体外诱导更大程度的癌细胞死亡非交联激动剂（激动性抗体和/或重组配体）。 CD40受体集中体现了TNF受体 - 配体相互作用的这种基本特性，因为CD40交联的程度决定了细胞命运。膜呈递CD40配体（mCD40L），但不是可溶性激动剂（例如，激动性抗CD40抗体），诱导高水平的促炎细胞因子分泌并导致恶性肿瘤细胞广泛死亡（细胞凋亡）但不是正常的）上皮细胞。在本文中，我们描述了通过mCD40L激活CD40并随后检测细胞凋亡的各种特征（包括细胞膜透化，DNA片段化，半胱天冬酶活化）以及细胞内细胞死亡介质检测的共培养系统（包括衔接蛋白，促凋亡激酶和活性氧，ROS）。
【背景】TNFR及其配体在调节淋巴组织以及上皮（尤其是癌）细胞中的细胞增殖或死亡中的作用已经在广泛研究中，因为它们诱导细胞死亡（主要通过细胞凋亡）的能力代表了有希望的目标。用于癌症治疗。然而，重要的是，当以可溶性对膜结合形式存在时，TNFR激动剂引发细胞死亡的能力存在明显差异。当作为单独治疗施用时，可溶性激动剂通常表现出相对低的细胞毒性效力，而膜呈递的配体似乎是优越的（Albarbar ...
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| Host-regulated Hepatitis B Virus Capsid Assembly in a Mammalian Cell-free System
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] The hepatitis B virus (HBV) is an important global human pathogen and represents a major cause of hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer. The HBV capsid is composed of multiple copies of a single viral protein, the capsid or core protein (HBc), plays multiple roles in the viral life cycle, and has emerged recently as a major target for developing antiviral therapies against HBV infection. Although several systems have been developed to study HBV capsid assembly, including heterologous overexpression systems like bacteria and insect cells, in vitro assembly using purified protein, and mammalian cell culture systems, the requirement for non-physiological concentrations of HBc and salts and the difficulty in manipulating host regulators of assembly presents major limitations ...
[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，并且是肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因。 HBV衣壳由单个病毒蛋白的多个拷贝组成，衣壳或核心蛋白（HBc）在病毒生命周期中起着多重作用，并且最近已经成为开发抗HBV病毒疗法的主要靶标。尽管已经开发了几种用于研究HBV衣壳组装的系统，包括异源过表达系统如细菌和昆虫细胞，使用纯化蛋白质和哺乳动物细胞培养系统进行体外组装，但对非生理浓度HBc和盐以及难以操纵装配的宿主调节物在生理相关条件下的衣壳装配的详细研究方面存在主要限制。我们最近开发了基于兔网织红细胞裂解物（RRL）的哺乳动物无细胞系统，其中HBc以生理浓度表达并在近生理条件下组装成衣壳。该系统已经揭示了HBc装配要求，这是以前装配系统所不能预料的。此外，该系统中的衣壳组装受可容易操作的内源宿主因子调控。在这里，我们提供了这种无细胞衣壳装配系统的详细协议，包括如何操纵调节装配的宿主因子的说明。
【背景】乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，其长期感染全世界数以亿计的人并且代表病毒性肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因（Seeger等人， 2013; Trepo et。，2014）。 HBV通过逆转录RNA中间体（所谓的前基因组RNA（pgRNA））在核衣壳内（NC）复制其基因组DNA（一种宽松的环状部分双链DNA（RC ...
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| In vitro NLK Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions to perform an in vitro kinase assay for nemo-like kinase. In addition, this protocol also describes an efficient method using mild lysis buffer for expression and purification of Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins.
[摘要] 该协议提供了一步一步的指导，以进行nemo样激酶的体外激酶测定。 此外，该方案还描述了使用温和裂解缓冲液来表达和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的有效方法。
【背景】果蝇nemo已经被确定为在发育中的果蝇眼中光感受器簇的关键调节剂（Choi和Benzer，1994）。 据报道，nemo是不同物种间保守的。 该哺乳动物同系物是类似于Nemo的激酶（NLK）（Brott等人，1998; Rocheleau等人，1999）。 NLK是CMGC集团（CDK，MAPK，GSK3和CLK）的成员，也属于非典型的MAPK家族。 NLK通过转录因子调节多种细胞机制，所述转录因子包括在不同信号传导途径中的关键参与者TCF / LEF1，NICD和FOXO（Ishitani等人，1999; Ishitani等人， ，2010; Kim等人，2010）。 此外，最近我们已经将NLK鉴定为Yes相关蛋白（YAP）的新型激酶，YAP是Hippo途径中的共转录激活剂（Moon等人，2017）。 该协议描述了用于测量类似尼莫地来激酶活性的体外方法。
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