| Affinity Purification of the RNA Degradation Complex, the Exosome, from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The following protocol describes an approach to purify RNA exosome complexes from HEK-293 cells, making use of inducible ectopic expression, affinity capture, and rate-zonal centrifugation. The obtained RNA exosomes have been used successfully for proteomic, structural, and enzymatic studies (Domanski et al., 2016).
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。以下方案描述了从HEK-293细胞中纯化RNA外来体复合物的方法，利用可诱导的异位表达，亲和力捕获和速率 - 区带离心。所获得的RNA外来体已被成功地用于蛋白质组学，结构和酶学研究（Domanski等人，2016）。
在我们以前的工作中，我们建立了在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo Fisher）的控制下表达C末端3xFLAG标记的外来体组分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / em>。，2012）。进一步探索使用的蛋白质提取条件，我们开发了一种允许在亲和捕获的外来体内保留DIS3（RRP44）的方案，否则证明是困难的（Hakhverdyan等人，2015）。基于这些研究，我们通过使用甘油密度梯度的速率区带离心法进一步纯化了RNA外来体（+/- DIS3）（Domanski等人，2016）。虽然蛋白质提取物中洗涤剂CHAPS（3 - ...
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| Purification of 70S Ribosomes from Bacillus subtilis
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Author:
Date:
2015-04-05
[Abstract] The eubacterial ribosome (70S) is a macromolecular complex that is composed of a small (30S) subunit and a large (50S) subunit. The small subunit comprises the 16S ribosomal RNA (rRNA) and more than 20 ribosomal proteins (r-proteins), whereas the large subunit comprises the 23S and 5S rRNAs and more than 30 r-proteins. Bacillus subtilis (B. subtilis) has 57 r-ribosomal protein genes and three rRNAs (16S, 23S and 5S rRNAs). Among them, we identified 21 r-proteins of the small subunit and 31 r-proteins of the large subunit in B. subtilis (Nanamiya et al., 2004). The functions and roles of individual components of the ribosome have not yet been completely clarified. Herein we describe in detail an ultracentrifugation-based protocol for the preparation of ...
[摘要] 真细菌核糖体（70S）是由小（30S）亚基和大（50S）亚基组成的大分子复合物。 小亚基包含16S核糖体RNA（rRNA）和超过20个核糖体蛋白（r-蛋白），而大亚基包含23S和5S rRNA和超过30个r蛋白。 枯草芽孢杆菌（<枯草芽孢杆菌）具有57个核糖体蛋白基因和三个rrna（16s，23s和5s rrna）。 其中，我们确定21 r蛋白的小亚基和31 r蛋白的大亚基在b。 枯草芽孢杆菌（nanamiya等人，2004）。 核糖体的各个组分的功能和作用尚未完全澄清。 在本文中，我们详细描述了从b的指数生长细胞制备70s核糖体的基于超速离心的方案。 枯草芽孢杆菌。
rrna）。="" 其中，我们确定21="" r蛋白的小亚基和31="" r蛋白的大亚基在b。="" 枯草芽孢杆菌（nanamiya等人，2004）。="" 核糖体的各个组分的功能和作用尚未完全澄清。="" 在本文中，我们详细描述了从b的指数生长细胞制备70s核糖体的基于超速离心的方案。="" 枯草芽孢杆菌。=""> ...
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