| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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| Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
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Date:
2017-09-05
[Abstract] Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content.
[摘要] 细胞外囊泡（EVs）通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车，但是它们最近才被孤立，并且关于它们的生物发生，释放，摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV，以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡（EVs）是介导蛋白质，脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力，对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究，以及生物流体的增长列表（Colombo等，2014）。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用，但比较缺乏（An et al。，2007; Davis et al。，2016）。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到，使用透射电子显微镜，但直到2009年才开发出分离方法（Halperin和Jensen，1967）。 ...
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| Protocol for Enrichment of the Membrane Proteome of Mature Tomato Pollen
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Author:
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2017-06-05
[Abstract] We established and elaborated on a method to enrich the membrane proteome of mature pollen from economically relevant crop using the example of Solanum lycopersicum (tomato). To isolate the pollen protein fraction enriched in membrane proteins, a high salt concentration (750 mM of sodium chloride) was used. The membrane protein-enriched fraction was then subjected to shotgun proteomics for identification of proteins, followed by in silico analysis to annotate and classify the detected proteins.
[摘要] 我们建立并阐述了利用番茄茄子（番茄）的例子丰富经济相关作物的成熟花粉膜蛋白质组的方法。为了分离富含膜蛋白质的花粉蛋白质级分，使用高盐浓度（750mM氯化钠）。然后将富含膜蛋白的级分进行霰弹枪蛋白质组学鉴定蛋白质，然后进行计算机分析，以对所检测的蛋白质进行注释和分类。
背景 由于蛋白质和溶质在不同细胞区室之间的适当分布或将新合成的蛋白质插入膜中很大程度上取决于膜蛋白质，所以膜蛋白质组是维持细胞和细胞器内稳态的核心（Paul等人 2013，2014和2016a）。考虑到膜蛋白的重要性，这些对于花粉功能和发育也是至关重要的（Paul等人，2016b）。许多全球花粉蛋白质组学研究已经在过去进行（Chaturvedi等人，2013和2016）;然而，很少讨论关于蛋白质的胞内分布和膜蛋白质组学在花粉中的组成的信息（Pertl et al。，2009）。一个原因可能是膜蛋白的低丰度和溶解度。在这里，我们描述了一种方法，用于分离和分析富含成熟花粉的膜蛋白的蛋白质级分，这是为番茄建立的（图1）。
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