| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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| Characterizing the Transcriptional Effects of Endolysin Treatment on Established Biofilms of Staphylococcus aureus
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Biofilms are the most common lifestyle of bacteria in both natural and human environments. The organized structure of these multicellular communities generally protects bacterial cells from external challenges, thereby enhancing their ability to survive treatment with antibiotics or disinfectants. For this reason, the search for new antibiofilm strategies is an active field of study. In this context, bacteriophages (viruses that infect bacteria) and their derived proteins have been proposed as promising alternatives for eliminating biofilms. For instance, endolysins can degrade peptidoglycan and, ultimately, lyse the target bacterial cells. However, it is important to characterize the responses of bacterial cells exposed to these compounds in order to improve the design of phage-based ...
[摘要] 生物膜是自然和人类环境中最常见的细菌生活方式。这些多细胞社区的有组织结构通常保护细菌细胞免受外部挑战，从而增强其抗生素或消毒剂治疗的生存能力。为此，寻找新的抗菌膜策略是一个积极的研究领域。在这种情况下，已提出噬菌体（感染细菌的病毒）及其衍生蛋白作为消除生物膜的有希望的替代物。例如，内溶素可降解肽聚糖，并最终裂解靶细菌细胞。然而，表征暴露于这些化合物的细菌细胞的反应以改进基于噬菌体的抗微生物策略的设计是重要的。
如以前在Fernández等人（2017）中所描述的，开发该协议以检查暴露于内溶素处理的金黄色葡萄球菌生物膜细胞的转录反应。然而，它可能随后适用于分析其他微生物对不同抗菌剂的反应。
【背景】越来越清楚的是，亚抑制剂量的抗菌剂可能对目标微生物的不同表型具有调节作用，包括生物膜形成，代谢或毒力。因此，研究新化合物对低浓度靶细胞的潜在影响应该是发展过程的一部分。事实上，引发毒力因子或抗生素耐药决定簇产生的非常有效的抗菌剂可能不是治疗应用的良好候选者。另一方面，考虑到生物膜和浮游细胞之间的生理差异，应该对生物膜形成细胞分析新抗生物膜剂的作用似乎是合乎逻辑的。在这里，我们描述了一种协议，用于分析生物膜细胞在亚抑制浓度的内抑素浓度下的转录反应，噬菌体来源的蛋白质作为生物膜去除剂展现出巨大的前景。因此，通过RNA-seq将内溶素处理的细胞的转录组与对照细胞进行比较，并且后来通过RT-qPCR证实了所选基因的差异表达。 ...
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| A Ribosome Footprinting Protocol for Plants
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Ribosome footprinting, or Ribo-seq, has revolutionized the studies of translation. It was originally developed for yeast and mammalian cells in culture (Ingolia et al., 2009). Herein, we describe a plant-optimized hands-on ribosome footprinting protocol derived from previously published procedures of polysome isolation (Ingolia et al., 2009; Mustroph et al., 2009) and ribosome footprinting (Ingolia et al., 2009; Ingolia et al., 2013). With this protocol, we have been able to successfully isolate and analyze high-quality ribosomal footprints from different stages of in vitro grown Arabidopsis thaliana plants (dark-grown seedlings [Merchante et al., 2015] and 13-day-old plantlets in plates and plants grown in liquid ...
[摘要] 核糖体足迹或Ribo-seq，彻底改变了翻译研究。它最初是为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的（Ingolia等人，2009）。本文中，我们描述了来自先前公开的多核糖体分离程序的植物优化的亲手核糖体印迹方案（Ingolia等人，2009; Mustroph等人，2009 ）和核糖体印迹（Ingolia等人，2009; Ingolia等人，2013）。使用该协议，我们能够成功地分离和分析来自体外生长的拟南芥植物（黑暗生长的幼苗）的不同阶段的高质量核糖体印迹[Merchante < ，以及在液体培养物中生长的板和植物中的13天龄小植物[未发表的结果]）。
[背景] 翻译在调节基因活性中的中心作用早已被公认，但是在响应于特定刺激的全基因组翻译定量变化的系统探索最近才变得技术上可行。最初为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的核糖体印迹技术（通常称为Ribo-seq）已经彻底改变了翻译调节和基因表达的研究，因为其允许确定核糖体在基因组 - ...
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