| Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of multiple sgRNAs within the same nucleus. However, an ongoing concern of the CRISPR field has been the accidental targeting of Cas9 to alternative (‘off-target’) DNA locations within a genome. We ...
[摘要] 鉴于CRISPR（集群定期间隔短回归重复）编辑技术的出现，基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链（单向导）RNA（sgRNA）片段结合到相应的基因组靶序列，引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA，修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位（称为“多重”）。然而，CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代（“脱靶”）DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用（称为人造基因座上的Cas9复制）描述为允许（i）与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; （ii）减少/消除可能的脱靶效应，以及（iii）精确控制预定目标序列的放置。
【背景】CRISPR（集群定期间隔回归重复）机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统（Jinek等，2012; Sorek等，2013）。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌（或othologous物种）的内切核酸酶（Cas9），单个RNA'引导'序列和外源供体DNA（如果需要）。仅在短短几年内，CRISPR / ...
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| Electroshock Induced Seizures in Adult C. elegans
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The nematode Caenorhabditis elegans is a useful model organism for dissecting molecular mechanisms of neurological diseases. While hermaphrodite C. elegans contains only 302 neurons, the conserved homologous neurotransmitters, simpler neuronal circuitry, and fully mapped connectome make it an appealing model system for neurological research. Here we developed an assay to induce an electroconvulsive seizure in C. elegans which can be used as a behavioral method of analyzing potential anti-epileptic therapeutics and novel genes involved in seizure susceptibility. In this assay, worms are suspended in an aqueous solution as current is passed through the liquid. At the onset of the shock, worms will briefly paralyze and twitch, and shortly after regain normal ...
[摘要] 线虫秀丽隐杆线虫是解剖神经系统疾病分子机制的有用的模型生物。而雌雄同体线虫仅包含302个神经元，保守的同源神经递质，更简单的神经元电路和完全映射的连接体使其成为神经学研究的吸引人的模型系统。在这里，我们开发了一种诱发电刺激性癫痫发作的检测方法。线虫可用作分析潜在的抗癫痫药物和涉及癫痫发作敏感性的新基因的行为方法。在该测定中，当电流通过液体时，将蠕虫悬浮在水溶液中。在休克开始时，蠕虫会短暂瘫痪和抽搐，并在恢复正常的正弦运动后不久。运动恢复的时间被用作从癫痫发作恢复的指标，可以通过掺入改变神经元和肌肉兴奋性的药物来减少或延长。
背景 我们有兴趣使用强大的遗传模型，即秀丽隐杆线虫，开发可以容易地被药理学操作的电惊厥发作测定。无脊椎动物模型已被用于癫痫发作研究几十年（Lee和Wu，2002），但是没有专门研究电刺激性癫痫发作的方案。线虫。过去，多组已经开发出响应于化学前同质醇如GABA A受体阻断剂戊戊四唑（PTZ）和微毒素（PTX）以及乙酰胆碱酯酶抑制剂涕灭威分析麻痹的方法（Williams等人，2004; Vashlishan等人，2008）。虽然这些方法通常分析麻痹的时间，我们的方法量化了从电击诱发的癫痫发作恢复所需的时间（Risley等，2016）。
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| RNA Chromatin Immunoprecipitation (RNA-ChIP) in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2014-12-20
[Abstract] The RNA chromatin immunoprecipitation assay (RNA-ChIP) allows detection and quantification of RNA–protein interactions using in vivo cross-linking with formaldehyde followed by immunoprecipitation of the RNA–protein complexes. Here we describe the RNA–ChIP protocol that we have adapted for Caenorhabditis elegans (C. elegans) to detect interaction between the nuclear Argonaute CSR-1 (chromosome segregation and RNAi deficient) protein and its target nascent RNAs. We have used a transgenic strain expressing a recombinant long isoform of CSR-1 protein fused with N-terminal 3x FLAG epitope.
[摘要] RNA染色质免疫沉淀测定（RNA-ChIP）允许使用体内与甲醛交联，随后RNA-蛋白复合物的免疫沉淀来检测和定量RNA-蛋白质相互作用。 在这里我们描述我们已经适应于秀丽隐杆线虫（ C. elegans ）的RNA-ChIP协议以检测核Argonaute CSR-1（染色体分离和RNAi缺陷 ）蛋白及其目标新生RNA。 我们使用表达与N-末端3x FLAG表位融合的CSR-1蛋白的重组长同种型的转基因菌株。
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