| Visualization of RNA 3’ ends in Escherichia coli Using 3’ RACE Combined with Primer Extension
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] In this assay, 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNA 3’ Ends) followed by PE (primer extension), abbreviated as 3’ RACE-PE is used to identify the mRNA 3’ ends. The following protocol describes the amplification of the mRNA 3’ ends at the galactose operon in E. coli and the corresponding visualization of the PCR products through PE. In PE, the definite primer is 5’ end-labeled using [γ-(32) P] ATP and T4 polynucleotide kinase, which anneals to the specific DNA molecules within the PCR product of the 3’ RACE. The conventional PE can only be used to locate the 5’ end of an mRNA transcript since reverse transcriptase (RTase) polymerizes only in the 5’ → 3’ direction. Thus, Taq polymerase is used instead of RTase, PCR is performed. Therefore, we are able to locate the 3’ end of the ...
[摘要] 在该测定中，使用缩写为3'RACE-PE的3'RACE（cDNA3'末端快速扩增），随后是PE（引物延伸），以鉴定mRNA3'末端。以下方案描述E中半乳糖操纵子的mRNA 3'末端的扩增。并通过PE对相应的PCR产物进行可视化。在PE中，使用[γ-（32）P] ATP和T4多核苷酸激酶对确定的引物进行5'末端标记，其退火至3'RACE的PCR产物内的特定DNA分子。由于逆转录酶（RTase）仅在5'→3'方向聚合，常规PE只能用于定位mRNA转录物的5'末端。因此，使用Taq聚合酶代替RTase，进行PCR。因此，我们能够使用此测定法定位mRNA的3'末端。通过在变性8％尿素-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中分离DNA产物，可以直接显示和定量3'末端的相对量。 3'末端的确切位置可以通过比较这些最终的DNA产物与相应的DNA测序阶梯进行测序。
【背景】mRNA 3'末端的合成是E中的重要步骤。产生稳定的信使RNA（mRNA）的大肠杆菌。在真核细胞中，mRNA 3'末端形成是通过从内部磷酸二酯键切割，然后加入聚（A）尾;而在原核细胞中，通过终止转录或通过加工初级转录产生mRNA的3'末端（Altman和Robertson，1973; Nudler和Gottesman，2002; Zhao等人，1999年）。因此，分析mRNA ...
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| Biotinylated Micro-RNA Pull Down Assay for Identifying miRNA Targets
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] microRNA (miRNA) directly associates with its target transcripts (mRNA). This protocol describes a method for detection of direct interaction between miRNA and mRNA. The result of interaction helps screening the specific target mRNAs for a miRNA.
[摘要] microRNA（miRNA）与其目标转录物（mRNA）直接相关。 该方案描述了检测miRNA和mRNA之间直接相互作用的方法。 相互作用的结果有助于筛选miRNA的特异性靶mRNA。
背景 MiRNA是小的非编码调控RNA。 MiRNA通常通过与靶mRNA中的互补序列结合来控制基因表达。 许多生物信息学和计算程序可用于预测miRNA靶标。 但是鉴定miRNA与靶mRNA的直接相关性的实验方法非常有限。 目前的方案可以非常有助于识别miRNA靶标（Phatak等人，2016）。
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| Product Analysis of Starch Active Enzymes by TLC
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Date:
2015-10-20
[Abstract] Thin layer chromatography (TLC) is a useful technique for detecting the presence of monosaccharides through to oligosaccharides, though it needs to be optimized for the specific sugars that are analyzed. Here we present a method for visualizing the reaction product(s) of starch active enzymes, which can contain α-1, 4 linked and α-1, 6 linked glucose. This was first published in Molecular Microbiology (Cockburn et al., 2015). The TLC protocol is an adapted version of that published by Robyt and Mukerjea (Robyt and Mukerjea, 1994). For a summary of the products generated by starch active enzymes see the review by Hii et al. (2012).
[摘要] 薄层色谱（TLC）是用于检测单糖通过寡糖的存在的有用技术，尽管它需要针对所分析的特定糖进行优化。 在这里我们提出一种可视化的淀粉活性酶，可以包含α-1,4连接和α-1,6连接葡萄糖的反应产物的方法。 这首次发表于Molecular Microbiology（Cockburn等人，2015年）。 TLC方案是由Robyt和Mukerjea（Robyt和Mukerjea，1994）发表的适应版本。 对于由淀粉活性酶产生的产物的概述，参见Hii等人（2012）的综述。
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