| Transcytosis Assay for Transport of Glycosphingolipids across MDCK-II Cells
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Absorption and secretion of peptide and protein cargoes across single-cell thick mucosal and endothelial barriers occurs by active endocytic and vesicular trafficking that connects one side of the epithelial or endothelial cell (the lumen) with the other (the serosa or blood). Assays that assess this pathway must robustly control for non-specific and passive solute flux through weak or damaged intercellular junctions that seal the epithelial or endothelial cells together. Here we describe an in vitro cell culture Transwell assay for transcytosis of therapeutic peptides linked covalently to various species of the glycosphingolipid GM1. We recently used this assay to develop technology that harnesses endogenous mechanism of lipid sorting across epithelial cell barriers to enable ...
[摘要] 单细胞厚粘膜和内皮屏障上的肽和蛋白质货物的吸收和分泌通过活性内吞和囊泡运输发生，其连接上皮细胞或内皮细胞（管腔）的一侧与另一侧（浆膜或血液）。 评估该途径的测定必须通过弱的或受损的细胞间连接强有力地控制非特异性和被动的溶质通量，所述细胞间连接将上皮细胞或内皮细胞密封在一起。 在这里，我们描述了一种体外>细胞培养Transwell测定法，用于与各种鞘糖脂GM1共价连接的治疗性肽的转胞吞作用。 我们最近使用该测定开发了技术，该技术利用跨上皮细胞屏障的脂质分选的内源机制，以实现肽和蛋白质治疗剂的口服递送。
【背景】
大分子穿过覆盖粘膜表面的单细胞厚的上皮屏障和衬在供给心肌和脑的血管的紧密内皮屏障上的运输通过内吞过程发生，该内吞过程将这些极化细胞的一侧与另一侧连接。该过程称为转胞吞作用（Garcia-Castillo et al。>，2017）。通过受体介导的内吞作用和穿过消化道和呼吸道粘膜的囊泡运输的免疫球蛋白的吸收和分泌最着名的是这一过程。对转胞吞作用的兴趣也受到利用该途径在紧密上皮和内皮屏障上递送治疗性肽和蛋白质的潜力的刺激（Thuenauer 等人，>，2017）。
转胞吞作用是一种活跃的（ATP驱动的）过程。在一些情况下，通过细胞间紧密连接在细胞周围被动扩散可以发生大分子跨越紧密上皮和内皮屏障的转运（Fung ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included intra-nucleosomal H3 crosslinking using dimethyl suberimidate (DMS). Here, we provide a detailed protocol for the use of DMS to analyze yeast nucleosomes.
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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| Conditional Knockdown of Proteins Using Auxin-inducible Degron (AID) Fusions in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Toxoplasma gondii is a member of the deadly phylum of protozoan parasites called Apicomplexa. As a model apicomplexan, there is a great wealth of information regarding T. gondii’s 8,000+ protein coding genes including sequence variation, expression, and relative contribution to parasite fitness. However, new tools are needed to functionally investigate hundreds of putative essential protein coding genes. Accordingly, we recently implemented the auxin-inducible degron (AID) system for studying essential proteins in T. gondii. Here we provide a step-by-step protocol for examining protein function in T. gondii using the AID system in a tissue culture setting.
[摘要] 弓形虫是原生动物寄生虫称为Apicomplexa致命门的一员。 作为一个复杂的模型，关于T的信息有很多。 gondii的8,000多种蛋白质编码基因，包括序列变异，表达和对寄生虫适应的相对贡献。 然而，需要新的工具来功能性地调查数百个推定的必需蛋白质编码基因。 因此，我们最近实施了生长素诱导降解（AID）系统来研究T中的基本蛋白质。弓形虫。 在这里，我们提供了一个检查蛋白质功能的一步一步的协议。 在组织培养环境中使用AID系统。
【背景】生长素是一类通过靶向某些蛋白质在植物中进行蛋白酶体降解而发出信号的植物激素（Teale等人，2006）。 Kohei Nishimura等人具有将该植物特异性信号传导系统的组分转移到其他真核生物中用于有兴趣的蛋白质（POI）的条件调节，创建生长素诱导降解（AID）系统的聪明想法（Nishimura等人，2009）。这个系统已经被成功地用于几种真核生物，包括疟原虫疟原虫（Kreidenweiss et al。，2013; Philip和Waters，2015）。只需要两个转基因成分来实现这个系统，称为转运抑制剂反应1（TIR1）的植物生长素受体和用AID标记的POI。用生长素（例如，3-吲哚乙酸/ IAA）处理活化SCF ...
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