| Uptake Assays in Xenopus laevis Oocytes Using Liquid Chromatography-mass Spectrometry to Detect Transport Activity
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Xenopus laevis oocytes are a widely used model system for characterization of heterologously expressed secondary active transporters. Historically, researchers have relied on detecting transport activity by measuring accumulation of radiolabeled substrates by scintillation counting or of fluorescently labelled substrates by spectrofluorometric quantification. These techniques are, however, limited to substrates that are available as radiolabeled isotopes or to when the substrate is fluorescent. This prompted us to develop a transport assay where we could in principle detect transport activity for any organic metabolite regardless of its availability as radiolabeled isotope or fluorescence properties.
In this protocol we describe the use of X. laevis oocytes ...
[摘要] 非洲爪蟾卵母细胞是用于表征异源表达的第二活性转运蛋白的广泛使用的模型系统。历史上，研究人员依靠通过闪烁计数或荧光标记的底物通过分光荧光定量测量放射性标记底物的积累来检测运输活动。然而，这些技术仅限于可用作放射性标记的同位素的底物或当底物是荧光时。这促使我们开发了一种运输测定法，我们可以原则上检测任何有机代谢物的转运活性，无论其作为放射性标记的同位素或荧光性质如何。
在这个协议中，我们描述了X的使用。卵母细胞作为表达次要活性转运蛋白的异源宿主，以及如何进行摄取测定，然后通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）检测和定量运输的代谢物。我们已经成功地使用这种方法来鉴定和表征称为硫代葡萄糖苷和氰基葡糖苷的植物防御代谢物的转运蛋白（Jørgensen等人，2017），然而该方法可用于表征任何转运蛋白底物可以通过LC-MS检测。
【背景】来自非洲爪蟾蛙（Xenopus laevis）的卵母细胞是用于异源表达和表征膜蛋白（即，转运蛋白和通道）的完整表达系统。 X。卵母细胞表达少量内源性膜蛋白，具有低的背景转运活性。此外，来自植物的次要活性转运蛋白（Boorer等人，1992; Theodoulou和Miller，1995; Nour-Eldin等人，2006），动物（Sumikawa 1981）; ...
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| Ex vivo Ooplasmic Extract from Developing Drosophila Oocytes for Quantitative TIRF Microscopy Analysis
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Understanding the dynamic behavior and the continuously changing composition of macromolecular complexes, subcellular structures and organelles is one of areas of active research in both cell and developmental biology, as these changes directly relate to function and subsequently to the development and homeostasis of the organism. Here, we demonstrate the use of the developing Drosophila oocyte to study dynamics of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) with high spatiotemporal resolution. The combination of Drosophila genetics with total internal reflection (TIRF) microscopy, image processing and data analysis gives insight into mRNP motility and composition dynamics with unprecedented precision.
[摘要] 了解大分子复合物，亚细胞结构和细胞器的动态行为和不断变化的组成是细胞和发育生物学中积极研究的领域之一，因为这些变化与功能和随后的生物体的发育和稳态直接相关。 在这里，我们演示了使用发展中的果蝇卵母细胞来研究具有高时空分辨率的信使核糖核蛋白复合物（mRNPs）的动力学。 果蝇的遗传学与全内反射（TIRF）显微镜，图像处理和数据分析结合，以前所未有的精确度了解了mRNP的运动性和组成动力学。
【背景】细胞内运输是活细胞的基本过程之一。几乎细胞内的所有细胞 - 离子，分子，复合物，细胞器 - 被积极地传输，使局部熵减少。尽管近年来，我们对这些运输过程的机理有了很大的了解，但我们的大部分知识来自于体外和细胞培养研究。在这些简化的系统中，很难确定是否利用运输监管流程的全部潜力。另一方面，组织，器官，组织和生物体通常太复杂，无法有效地研究时空分辨率，足以匹配这些运输过程的规模。为了结合自下而上和自上而下的方法的优点，已经开发了在保持复杂性的同时，使这些过程更易于访问的技术。一个例子是从ambiphian（例如，非洲爪蟾）卵母细胞和胚胎中制备大量细胞质提取物来研究细胞分裂（Lohka和Masui，1983; Murray，1991; Sawin和Mitchison，1991）。我们最近显示，在细胞质液滴 - ...
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| Fluorescently Labelled Aerolysin (FLAER) Labelling of Candida albicans Cells
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] In this protocol we describe a nonradiolabelled labelling of GPI anchor in Candida albicans. The method uses a fluorescent probe to bind specifically to GPI anchors so that the level of GPI-anchored proteins at the cell surface can be measured. The labelling does not need permeabilization of cells and can be carried out in vivo.
[摘要] 在本协议中，我们描述了白色念珠菌中GPI锚的非放射性标记标记。该方法使用荧光探针特异性结合GPI锚点，从而可以测量细胞表面的GPI锚定蛋白的水平。标记不需要细胞的透化，并且可以在体内进行进行。
背景 GPI（糖基磷脂酰肌醇）锚是在内质网（ER）中发生的翻译后修饰。预先形成的GPI锚定体连接到携带GPI锚定附着信号序列的特异性蛋白质的C末端的ER的内腔中。这些蛋白质随后通过分泌途径转移（并进一步修饰）到细胞表面，其中蛋白质锚定在质膜的细胞外小叶上或共价连接到具有壁的生物中的细胞壁。各种蛋白质在真核生物中获得GPI锚定蛋白，例如水解酶，细胞表面粘附分子或受体蛋白（Orlean和Menon，2007）。在真菌病原体中，例如白色念珠菌，参与宿主识别和粘附的许多粘附素以及几种发病机理和毒力因子是GPI锚定蛋白;此外，白色念珠菌中的几种GPI锚定蛋白具有蛋白水解活性（Richard和Plaine，2007; Nobile等人，2008）。该途径在白色念珠菌中是必不可少的，并且其下调或靶向它可能是打击念珠菌感染的有用策略。本文详细阐述了用于评估白色念珠菌中GPI锚定水平的方案。
＆NBSP;荧光标记的Aerolysin（FLAER）是荧光素标记的非溶性细胞溶解素的无活性衍生物，革兰氏阴性细菌毒素，其与真核宿主的细胞膜中的GPI锚定的蛋白质结合并形成孔（Howard等， ...
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