| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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| Hypoxia Studies with Pimonidazole in vivo
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Author:
Date:
2014-10-05
[Abstract] Therapy-induced hypoxia drives changes in the tumor microenvironment that contribute to the poor response to therapy. Hypoxia is capable of driving the expression and/or activation of specific signaling cascades (e.g., c-Met, Axl, CTGF), the recruitment of tumor promoting immune cells, and the induction of cell survival pathways including autophagy (Phan et al., 2013; Hu et al., 2012; Ye et al., 2010). We have recently shown that anti-VEGF therapy-induced hypoxia can result in changes in the extracellular matrix that contribute to the aggressiveness of tumors post therapy (Aguilera et al., 2014). Importantly, therapies that induce hypoxia do not always increase epithelial plasticity and tumor aggressiveness (Ostapoff et al., 2013; ...
[摘要] 治疗诱导的缺氧驱动肿瘤微环境中的变化，其导致对治疗的差的反应。缺氧能够驱动特异性信号级联（例如，c-Met，Axl，CTGF）的表达和/或活化，肿瘤促进免疫细胞的募集和细胞存活途径的诱导，包括自噬（Phan等人，2013; Hu等人，2012; Ye等人，2010）。我们最近已经显示，抗VEGF治疗诱导的缺氧可以导致细胞外基质的变化，其有助于治疗后肿瘤的侵袭性（Aguilera等人，2014）。重要的是，诱导缺氧的治疗不总是增加上皮可塑性和肿瘤侵袭性（Ostapoff等人，2013; Cenik等人，2013）。我们已经使用哌莫硝唑来评价肿瘤中的缺氧，并且在本文中为这种有用的工具提供详细的方案来询问体内缺氧水平。
Hypoxyprobe TM （哌莫硝唑盐酸盐）免疫组织化学分析方法的实用性允许评估不同组织以及细胞类型中的缺氧。哌莫硝唑是2-硝基咪唑，其在缺氧细胞中特异性地被还原活化，并与蛋白质，肽和氨基酸中的巯基形成稳定的加合物（Cenik等人，2013; Arnold等人。，2010; Raleigh和Koch，1990; Raleigh等人，1998）。此外，检测到的吡莫硝唑的量与肿瘤内的缺氧水平成正比
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