| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
|
|
|
| Primary Culture System for Germ Cells from Caenorhabditis elegans Tumorous Germline Mutants
|
|
Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The Caenorhabditis elegans germ line is an important model system for the study of germ stem cells. Wild-type C. elegans germ cells are syncytial and therefore cannot be isolated in in vitro cultures. In contrast, the germ cells from tumorous mutants can be fully cellularized and isolated intact from the mutant animals. Here we describe a detailed protocol for the isolation of germ cells from tumorous mutants that allows the germ cells to be maintained for extended periods in an in vitro primary culture. This protocol has been adapted from Chaudhari et al., 2016.
[摘要] 秀丽隐杆线虫种系是胚芽干细胞研究的重要模型系统。 野生型C。 线虫生殖细胞是合胞体，因此不能在体外培养中分离。 相比之下，来自肿瘤突变体的生殖细胞可以完全被细胞化并从突变动物中完整分离。 在这里，我们描述了从肿瘤突变体中分离生殖细胞的详细方案，其允许生殖细胞在体外原代培养中长时间维持。 该协议已从2016年Chaudhari等人改编。
【背景】秀丽生殖细胞在位于两个性腺臂的远端区域的两个成体干细胞龛中产生（Hansen和Schedl，2013; Kimble和Seidel，2013）。在野生型雌雄同体中，有丝分裂生殖细胞仅限于性腺臂的远端，干细胞生态位。野生型生殖细胞是合胞体，并且包含延伸通过性腺臂中心区域的共同细胞质的开口。 ℃。线虫肿瘤种系突变体在整个性腺中增加了生殖细胞的有丝分裂增殖。我们发现肿瘤种系突变体通常具有完整的细胞生殖细胞，其含有完整的质膜（Chaudhari等人，2016）。这种细胞化允许生殖细胞的分离及其在培养中的维持。该方案描述了分离和维持培养物中肿瘤突变体的生殖细胞的方法学和组织培养基。虽然已经描述了用于C的主要培养物的培养基。 elegans 胚胎和幼虫细胞（Strange等人，2007; Zhang和Kuhn，2013），生殖细胞在这种培养基中不能存活（Chaudhari等人。 ...
|
|
|
| Single-molecule RNA Fluorescence in situ Hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans
|
|
Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a technique to visualize individual RNA molecules using multiple fluorescently-labeled oligonucleotide probes specific to the target RNA (Raj et al., 2008; Lee et al., 2016a). We adapted this technique to visualize RNAs in the C. elegans whole adult worm or its germline, which enabled simultaneous recording of nascent transcripts at active transcription sites and mature mRNAs in the cytoplasm (Lee et al., 2013 and 2016b). Here we describe each step of the smFISH procedure, reagents, and microscope settings optimized for C. elegans extruded gonads.
[摘要] 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是使用针对靶RNA特异性的多个荧光标记寡核苷酸探针来观察个体RNA分子的技术（Raj等人，2008; Lee等，2016a）。 我们调整了这种技术可视化线虫整个成虫或其种系中的RNA，其能够同时记录活跃转录位点的新生转录物和细胞质中的成熟mRNA（Lee等，2013和2016b）。 在这里，我们描述针对秀丽隐杆线虫挤压性腺优化的smFISH程序，试剂和显微镜设置的每个步骤。
【背景】smFISH能够在体内直接和精确地定量mRNA。 此外，通过复用smFISH探针，可以在同一细胞中同时测定多个RNA物种。 以前的出版物在线虫中使用了smFISH，但是这些研究使用了宽视野显微镜，其通常具有较低的空间分辨率并需要额外的图像处理（例如，图像去卷积）（Ji和van Oudenaarden，2012）。 在这里，我们描述了针对秀丽隐杆线虫组织优化的smFISH程序。 每个步骤都是详细的，包括使用共焦显微镜来获得精确的测量。 我们的协议最大限度地减少了样品与样品的变异性，并允许精确定量mRNA和新生转录物。
|
|
|