| In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
|
|
Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants.
[摘要] I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是有效的组蛋白去蛋白酶，拓宽了这些重要（epi-）基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里，我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC，包括巴豆酰化组蛋白，并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。
【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面，包括基因表达（例如参见Pengelly et al。，2013;在Castillo 等人中综述，2017）。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合，例如核小体重塑因子（在Bannister和Kouzarides，2011中综述）。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如，通过组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）除去组蛋白乙酰化，其中存在几类。近年来，新的组蛋白赖氨酸酰化，包括琥珀酰化，丙酰化，丁酰化，羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物，并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性（Sabari 等人，2017）。特别是，组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关，并被认为受细胞代谢状态的影响（Sabari et al。，2015; Fellows et al。 ，2018年）。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质（Wei et al。，2017; Fellows et al。，2018）。
...
|
|
|
| Generation of Chemically Induced Liver Progenitors (CLiPs) from Rat Adult Hepatocytes
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Primary mature hepatocytes (MHs) or their progenitor cells are candidate cell sources for cell transplantation therapy in severe liver diseases. However, stable culture of these cells or generation of equivalent cells from pluripotent stem cells has been limited. Using a cocktail of small molecules that we previously found useful in stable culture of multiple types of stem/progenitor cells, we recently established a novel method to generate bipotent liver progenitor cells, named chemically induced liver progenitors (CLiPs), from adult rat MHs. Here, we describe a detailed protocol for the induction of rat CLiPs. We first describe the method to isolate primary rat MHs and then describe how to induce CLiPs from these MHs. In addition, we describe a method to evaluate the bipotentiality of ...
[摘要] 原代成熟肝细胞（MH）或其祖细胞是重症肝病中细胞移植治疗的候选细胞来源。然而，这些细胞的稳定培养或多能干细胞的等效细胞的产生受到限制。我们使用先前在多种类型的干/祖细胞稳定培养中发现有用的小分子混合物，最近建立了一种从成年大鼠MHs产生双能肝脏祖细胞（命名为化学诱导肝祖细胞（CLiPs））的新方法。在这里，我们描述了诱导大鼠CLiPs的详细方案。我们首先描述分离原代鼠MH的方法，然后描述如何从这些MH中诱导CLiPs。另外，我们描述了一种评估产生的CLiPs分化成肝细胞和胆管上皮细胞的双能性的方法。我们还介绍了如何通过长期的文化和详细的示例数据建立稳定的CLiP。可以在2周内产生初级CLiPs，并且可以在2.5-4个月内建立经历10次传代的稳定的CLiPs，批次间变异性。
【背景】对于实现肝病再生医学的新型细胞来源有着强烈的需求。目前唯一的治疗终末期肝病的方法是肝移植，但是由于供者短缺，其应用受到限制。最近，我们小组提出了一种产生能够在体外稳定地扩增的新型LPC的方法，并且可以以广泛的效率重新繁殖慢性肝炎动物模型的损伤肝脏（Katsuda等人， / ...
|
|
|
| Single-molecule Analysis of DNA Replication Dynamics in Budding Yeast and Human Cells by DNA Combing
|
|
Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The DNA combing method allows the analysis of DNA replication at the level of individual DNA molecules stretched along silane-coated glass coverslips. Before DNA extraction, ongoing DNA synthesis is labeled with halogenated analogues of thymidine. Replication tracks are visualized by immunofluorescence using specific antibodies. Unlike biochemical and NGS-based methods, DNA combing provides unique information on cell-to-cell variations in DNA replication profiles, including initiation and elongation. Finally, this assay can be used to monitor the effect of DNA lesions on fork progression, arrest and restart.
[摘要] DNA梳理方法允许在沿着硅烷涂覆的玻璃盖玻片拉伸的单个DNA分子的水平上分析DNA复制。在DNA提取前，进行的DNA合成用胸苷的卤化类似物标记。使用特异性抗体通过免疫荧光可视化复制轨迹。与生物化学和基于NGS的方法不同，DNA梳理提供了DNA复制谱中细胞间细胞变化的独特信息，包括引发和延长。最后，该测定可用于监测DNA损伤对叉进展，停止和重新启动的影响。
背景 在称为复制起点的真核染色体上的数千个位点处启动DNA合成。原始激活遵循由检查点激酶和染色质的表观遗传修饰（Prioleau和MacAlpine，2016）控制的定义良好的复制计时程序。复制叉在正常S阶段经常停顿。叉停止是由多个事件引起的，例如DNA损伤，紧密结合的蛋白质复合物和高表达基因的转录（Tourriere和Pasero 2007; Zeman and Cimprich，2013）。真核生物已经制定了不同的策略来应对这种复制压力，包括修复机制来重新启动捕获的叉子和激活休眠复制起源以抢救终末抓捕的叉。
＆NBSP; ...
|
|
|