| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of specific types of cells, to enable downstream FACS isolation and bulk RNA sequencing. We show that this method can enable isolation and profiling of specific cell types from mouse retina, frozen human ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
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| Optic Nerve Crush in Mice to Study Retinal Ganglion Cell Survival and Regeneration
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] In diseases such as glaucoma, the failure of retinal ganglion cell (RGC) neurons to survive or regenerate their optic nerve axons underlies partial and, in some cases, complete vision loss. Optic nerve crush (ONC) serves as a useful model not only of traumatic optic neuropathy but also of glaucomatous injury, as it similarly induces RGC cell death and degeneration. Intravitreal injection of adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) has been shown to specifically and efficiently transduce RGCs in vivo and has thus been proposed as an effective means of gene delivery for the treatment of glaucoma. Indeed, we and others routinely use AAV2 to study the mechanisms that promote neuroprotection and axon regeneration in RGCs following ONC. Herein, we describe a step-by-step protocol to ...
[摘要] [摘要 ] 在青光眼等疾病中，视网膜神经节细胞（RGC）神经元无法存活或无法再生视神经轴突，这是部分视力丧失的原因，在某些情况下，甚至是完全的视力丧失。视神经挤压术（ONC）不仅可以作为创伤性视神经病变的一种有用模型，而且还可以作为青光眼损伤的有用模型，因为它类似地诱导RGC细胞死亡和变性。腺相关病毒血清型2（AAV2）的玻璃体内注射已被证明特别地和有效地转导视网膜神经节细胞在体内和已因而被提出作为基因递送用于治疗青光眼的治疗的有效手段。确实，我们和其他人常规使用AAV2来研究促进ONC 后RGC中神经保护和轴突再生的机制。本文中，我们描述了分步操作的方案，以测定AAV2介导的转导和ONC损伤后小鼠中RGC的存活和再生，包括1）玻璃体内注射AAV2病毒载体，2）视神经挤压，3）霍乱毒素B （CTB）标记再生轴突，4）视神经清除，5）视网膜平面免疫染色和6）定量RGC存活和再生。除了提供执行此协议所需的所有材料和程序详细信息之外，我们还强调了它比其他相似的已发表方法的优势，并提供了有用的技巧以确保其在任何现代实验室中都能如实复制。
[背景 ] 青光眼是世界范围内不可逆失明的主要原因，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐退化和丧失，这是构成连接视网膜与大脑的视神经的中央投射神经元（Quigley ，2011 ; Tham ...
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| In situ Hybridization (ISH) in Preparasitic and Parasitic Stages of the Plant-parasitic Nematode Meloidogyne spp.
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The spatio-temporal expression pattern of a gene provides important indications to better understand its biological function. In situ hybridization (ISH) uses a labeled complementary single-stranded RNA or DNA probe to localize gene transcripts in a whole organism, a whole organ or a section of tissue. We adapted the ISH technique to the plant parasite Meloidogyne spp. (root-knot nematode) to visualize RNAs both in free-living preparasitic juveniles and in parasitic stages settled in the plant tissues. We describe each step of the probe synthesis, digoxigenin (DIG) labeling, nematode extraction from plant tissue, and ISH procedure.
[摘要] 基因的时空表达模式为更好地理解其生物学功能提供了重要的指示。 原位杂交（ISH）使用标记的互补单链RNA或DNA探针来定位整个生物体，整个器官或一部分组织中的基因转录物。 我们将ISH技术应用于植物寄生虫
【背景】到目前为止，植物寄生性线虫的稳定转化尚未成功。 ISH能够在整个装载的Meloidogyne spp中分析体内时空基因表达。线虫。这些根结线虫在土壤中以微小蚓状幼虫（J2）形式孵化并感染宿主植物根部。 J2s穿透根部并迁移到根部维管柱状细胞。幼虫定居在根部，发育成J3和J4寄生幼鱼，诱导分化专化饲养细胞。线虫最终发育成梨形雌性，将在根表面释放数百个卵。在这里，我们报告了一个详细的协议来检测准备性整体安装J2s和寄生阶段中的单个RNA分子。寄生虫阶段的ISH需要在感染根部提取线虫前一天采取额外的程序。我们描述了在线虫整个组织中使用地高辛（DIG）标记的cDNA探针检测转录物。
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