| Microarray, IPA and GSEA Analysis in Mice Models
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] This protocol details a method to analyze two tissue samples at the transcriptomic level using microarray analysis, ingenuity pathway analysis (IPA) and gene set enrichment analysis (GSEA). Methods such as these provide insight into the mechanisms underlying biological differences across two samples and thus can be applied to interrogate a variety of processes across different tissue samples, conditions, and the like. The full method detailed below can be applied to determine the effects of muscle-specific Notch1 activation in the mdx mouse model and to analyze previously published microarray data of human liposarcoma cell lines.
[摘要] 该协议详述了使用微阵列分析，独创性途径分析（IPA）和基因集富集分析（GSEA）在转录组水平分析两个组织样品的方法。 诸如此类的方法提供了对两个样品之间的生物学差异的潜在机制的洞察，因此可以应用于跨越不同组织样品，条件等询问各种过程。 下面详述的完整方法可用于确定肌肉特异性Notch1激活在 mdx 小鼠模型中的作用，并分析先前公布的人脂肪肉瘤细胞系的微阵列数据。
【背景】各种细胞类型的转录组学分析对于阐明细胞的功能元件至关重要，可以深入了解细胞特异性特征，并可突出与不同发育或疾病阶段相关的变化（Wang et al。，2009） 。虽然RNA测序变得越来越流行，但分析的相对成本和时间可能是一种负担。因此，微阵列分析是比较各种mRNA样品之间相对基因表达水平的替代工具（Read et al。，2001）。微阵列通常用于研究与疾病状态相关的变化，其疾病状态的基因表达模式可以被推断或已经被定义（Amaratunga et al。，2007）。 Ingenuity途径分析（IPA，QIAGEN）通常与大规模组学数据结合使用，并提供有关不同样本可能显着改变的途径，基因和其他特征的信息。基因集富集分析（GSEA）使用与各种疾病或途径相关的先验的基因集和特征，以便为感兴趣的样品提供生物学应用。
Bi及其同事使用下述方法来理解Notch信号传导在肌肉再生和脂肪肉瘤中的作用，脂肪肉瘤是一种常见的软组织癌类型（Bi ...
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| Host-regulated Hepatitis B Virus Capsid Assembly in a Mammalian Cell-free System
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] The hepatitis B virus (HBV) is an important global human pathogen and represents a major cause of hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer. The HBV capsid is composed of multiple copies of a single viral protein, the capsid or core protein (HBc), plays multiple roles in the viral life cycle, and has emerged recently as a major target for developing antiviral therapies against HBV infection. Although several systems have been developed to study HBV capsid assembly, including heterologous overexpression systems like bacteria and insect cells, in vitro assembly using purified protein, and mammalian cell culture systems, the requirement for non-physiological concentrations of HBc and salts and the difficulty in manipulating host regulators of assembly presents major limitations ...
[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，并且是肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因。 HBV衣壳由单个病毒蛋白的多个拷贝组成，衣壳或核心蛋白（HBc）在病毒生命周期中起着多重作用，并且最近已经成为开发抗HBV病毒疗法的主要靶标。尽管已经开发了几种用于研究HBV衣壳组装的系统，包括异源过表达系统如细菌和昆虫细胞，使用纯化蛋白质和哺乳动物细胞培养系统进行体外组装，但对非生理浓度HBc和盐以及难以操纵装配的宿主调节物在生理相关条件下的衣壳装配的详细研究方面存在主要限制。我们最近开发了基于兔网织红细胞裂解物（RRL）的哺乳动物无细胞系统，其中HBc以生理浓度表达并在近生理条件下组装成衣壳。该系统已经揭示了HBc装配要求，这是以前装配系统所不能预料的。此外，该系统中的衣壳组装受可容易操作的内源宿主因子调控。在这里，我们提供了这种无细胞衣壳装配系统的详细协议，包括如何操纵调节装配的宿主因子的说明。
【背景】乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，其长期感染全世界数以亿计的人并且代表病毒性肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因（Seeger等人， 2013; Trepo et。，2014）。 HBV通过逆转录RNA中间体（所谓的前基因组RNA（pgRNA））在核衣壳内（NC）复制其基因组DNA（一种宽松的环状部分双链DNA（RC ...
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| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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