| TetR Regulated in vivo Repression Technology to Identify Conditional Gene Silencing in Genetically Engineerable Bacteria Using Vibrio cholerae Murine Infections as Model System
|
|
Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Investigation of bacterial gene regulation upon environmental changes is still a challenging task. For example, Vibrio cholerae, a pathogen of the human gastrointestinal tract, faces diverse transient conditions in different compartments upon oral ingestion. Genetic reporter systems have been demonstrated to be extremely powerful tools to unravel gene regulation events in complex conditions, but so far focused mainly on gene induction. Herein, we describe the TetR-controlled recombination-based in vivo expression technology TRIVET, which allows detection of gene silencing events. TRIVET resembles a modified variant of the in vivo expression technology (IVET) as well as recombination-based in vivo expression technology (RIVET), which were used to ...
[摘要] [摘要]研究细菌基因对环境变化的调控仍然是一项艰巨的任务。例如，人胃肠道的病原体霍乱弧菌在口服后会在不同的隔室中遇到各种短暂的状况。事实证明，遗传报告系统是揭示复杂条件下基因调控事件的极有力工具，但到目前为止，它主要集中在基因诱导上。在本文中，我们描述了基于TetR控制的重组的体内表达技术TRIVET，该技术可检测基因沉默事件。TRIVET类似于体内表达技术（IVET）以及基于重组的体内变异体 表达技术（RIVET），用于鉴定宿主定殖过程中几种细菌的条件基因诱导。像它的前辈一样，TRIVET是一个基于单细胞的报告系统，可以通过耐药谱的表型变化以时空方式分析细菌基因的阻遏。简而言之，无启动子的tetR （编码转录阻遏物TetR）可通过转座子诱变随机地整合到细菌基因组中，或通过同源重组在目标启动子的下游特异性整合到细菌基因组中。的TetR导致的去阻遏的转录表达的减少的TetR控制解离TNPR，这反过来又导致切除ö F A Ñ抗生素抗性盒（也称为RES-盒）和改变的电阻曲线可观察到的通过划线上氨苄青霉素和卡那霉素板。然后可以将这种改变量化为抗性和非抗性分离株之间的比例。此外，新引入的第二报道基因，promot erless ...
|
|
|
| High-level Production of Recombinant Membrane Proteins Using the Engineered Escherichia coli Strains SuptoxD and SuptoxR
|
|
Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] We have previously described the development of two specialized Escherichia coli strains for high-level recombinant membrane protein (MP) production. These engineered strains, termed SuptoxD and SuptoxR, are capable of suppressing the cytotoxicity caused by MP overexpression and of producing greatly enhanced MP yields. Here, we present a Bio-protocol that describes gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these strains.
[摘要] [摘要] 我们之前已经描述了两种用于生产高水平重组膜蛋白（MP）的大肠杆菌菌株的开发。这些工程菌株，称为SuptoxD和SuptoxR，能够抑制MP过度表达引起的细胞毒性，并产生显著提高的MP产量。在这里，我们提出一个生物协议，描述基因过度表达和培养条件，最大限度地积累膜整合和折叠良好的重组多磺酸粘多糖在这些菌株。
[背景]多磺酸粘多糖在所有活生物体的细胞中执行多种关键功能（Wagner et al.，2006；Schlegel et al.，2010），是当前和未来药物的主要靶点（Yildrim et al.，2007）。获得足够数量的分离蛋白是进行生化和结构研究的前提，这反过来又可以加深对其功能的理解，并发现新的MP靶向药物。
由于多磺酸粘多糖通常在其天然环境中以极低的丰度出现，异源宿主通常用于其重组过表达和随后的纯化。许多不同的系统已被用作原核和真核来源的多种多磺酸粘多糖的过表达宿主（Wagner等人，2006年）。其中，大肠杆菌是最受欢迎的一种，因为它的成本非常低，使用方便（Makino等人，2011年）。事实上，这种细菌已经成功地用于生产储存在蛋白质数据库中的所有重组产生的MP结构的大约20%（Dilworth等人，2018年）。尽管有这些优势和成功，但使用大肠杆菌作为MP生产的异源宿主通常伴随着严重的毒性、低水平的最终生物量和微小的最终产量（Miroux和Walker，1996；Wagner等人，2007；Link等人，2008；Gubellini等人，2011）。 ...
|
|
|
| Construction and Cloning of Minigenes for in vivo Analysis of Potential Splice Mutations
|
|
Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Disease-associated mutations influencing mRNA splicing are referred to as splice mutations. The majority of splice mutations are found on exon-intron boundaries defining canonical donor and acceptor splice sites. However, mutations in the coding region (exonic mutations) can also affect mRNA splicing. Exact knowledge of the disease mechanism of splice mutations is essential for developing optimal treatment strategies. Given the large number of disease-associated mutations thus far identified, there is an unmet need for methods to systematically analyze the effects of pathogenic mutations on mRNA splicing. As splicing can vary between cell types, splice mutations need to be tested under native conditions if possible. A commonly used tool for the analysis of mRNA splicing is the ...
[摘要] 影响mRNA剪接的疾病相关突变称为剪接突变。大多数剪接突变位于确定典型供体和受体剪接位点的外显子 - 内含子边界上。然而，编码区中的突变（外显子突变）也可影响mRNA剪接。准确了解剪接突变的疾病机制对于开发最佳治疗策略至关重要。鉴于迄今为止鉴定的大量疾病相关突变，尚未满足对系统分析致病突变对mRNA剪接的影响的方法的需求。由于不同细胞类型之间的拼接可能不同，如果可能的话，拼接突变需要在天然条件下进行测试。一种常用的分析mRNA剪接的工具是携带外显子和内含子序列的小基因的构建。在这里，我们描述了设计和克隆到重组腺相关病毒（rAAV）载体中用于基因递送和在本地环境中调查mRNA剪接的方案。该协议是为了基于小基因的视网膜细胞中mRNA剪接分析而开发的，但是原则上它适用于任何可以用rAAV载体转导的细胞类型。
【背景】预计大部分疾病相关突变（至少15％）会导致异常的mRNA剪接（Cartegni等，2002; Singh和Cooper，2012; Sterne-Weiler和Sanford，2014年）。 '经典'剪接突变是影响定义5'和3'剪接位点（分别为供体和受体剪接位点）的规范序列的突变。然而，剪接突变也可能发生在其他非编码区和编码区（Wang和Cooper，2007; ...
|
|
|