| Use of Geminivirus for Delivery of CRISPR/Cas9 Components to Tobacco by Agro-infiltration
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR/Cas9 system is a recently developed genome editing tool, and its power has been demonstrated in many organisms, including some plant species (Wang et al., 2016). In eukaryotes, the Cas9/gRNA complexes target genome sites specifically and cleave them to produce double-strand breaks (DSBs), which can be repaired by non-homologous end joining (NHEJ) pathway (Wang et al., 2016). Since NHEJ is error prone, mutations are thus generated. In plants, delivery of genome editing reagents is still challenging. In this protocol, we detail the procedure of a virus-based gRNA delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plant genome editing (VIGE). This method offers a rapid and efficient way to deliver gRNA into plant cells, especially for those that are recalcitrant to ...
[摘要] CRISPR / Cas9系统是最近开发的基因组编辑工具，其功能已被证实在许多生物体中，包括一些植物物种（Wang等人，2016）。 在真核生物中，Cas9 / gRNA复合物特异性地靶向基因组位点并切割它们以产生双链断裂（DSB），其可以通过非同源末端连接（NHEJ）途径修复（Wang等人， 。，2016）。 由于NHEJ易出错，因此产生突变。 在植物中，基因组编辑试剂的递送仍然是挑战性的。 在本协议中，我们详细介绍了CRISPR / Cas9介导的植物基因组编辑（VIGE）的基于病毒的gRNA传递系统的过程。 该方法提供了将gRNA递送到植物细胞中的快速且有效的方式，特别是对于那些难以转基因农杆菌的方法。
已经报道了基于病毒的基因组编辑技术使用解构DNA病毒和RNA病毒（Baltes等人，2014; Ali等人，2015）。 最近，我们使用了一种完整的双因素病毒 - 卷心菜叶卷曲病毒（CaLCuV）（一种感染广西芥菜科的成员，包括花椰菜的二分酵母病毒），用于高效率 第一次（Yin等人，2015年），其主机之一的基因组编辑（Nicotiana benhamiana）首次进行基因组编辑。
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| Polysome Analysis
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Polysome analysis is a method to separate mRNAs from a cell into actively translating and non-translating fractions depending on their association with polysomes. By this protocol, cell lysates are fractionated by sucrose density gradient ultracentrifugation. Free mRNA fraction and various ribosomal fractions, such as 40S, 60S, monosomes and polysomes are collected by fractionation. Association of particular mRNAs with these fractions is detected by reverse transcription – PCR to investigate the translational state of the mRNA.
[摘要] 多聚赖氨酸分析是一种将mRNA从细胞分离为主动翻译和非翻译部分的方法，这取决于它们与多核糖体的关联。通过该方案，通过蔗糖密度梯度超速离心分离细胞裂解物。通过分级收集游离mRNA级分和各种核糖体级分，例如40S，60S，单体和多核糖体。通过逆转录PCR检测特异性mRNA与这些级分的关联，以研究mRNA的翻译状态。
背景 细胞mRNA在任何时间点分布到主动翻译和非翻译池中，并可响应于各种刺激而在这些池之间动态地重新分布。主动翻译的mRNA具有较高数量的与它们相关的核糖体，与mRNA相关的核糖体数量是mRNA的翻译状态的量度。因此，从细胞中分离核糖体时，会在多核糖体组分中发现主要转录的mRNA，而在游离mRNA部分或与40S核糖体亚基相关的非翻译/不良翻译mRNAs。因此，多聚赖氨酸分析是根据其与多核糖体的关联将mRNA从细胞分离为主动翻译和非翻译部分的方法（Ray et al。，2009; Poria等人， >。，2016）。可以通过RT-PCR检测单个mRNA与翻译/非翻译级分的关联，而通过RNA测序或微阵列分析可以鉴定mRNA的整个翻译或非翻译池。
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| RNA-protein UV-crosslinking Assay
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] RNA-protein interactions play a crucial role in every aspect of RNA metabolism, and also plays a major role in post-transcriptional gene regulation. RNA-binding proteins have been implicated in viral gene expression (Ray and Das, 2002) and microRNA-mediated gene regulation (Poria et al., 2016). Here we have described the protocol which (1) covalently links transiently interacting RNA-protein complexes by UV crosslinking, (2) removes the unprotected RNA by RNase digestion and (3) detects the RNA-protein complexes by SDS-PAGE analysis. This protocol provides a rapid and reliable means to directly assay RNA-protein interactions and their kinetics using purified proteins and also help in identifying novel RNA-protein interactions
[摘要] RNA-蛋白质的相互作用在RNA代谢的各个方面发挥着至关重要的作用，并且在转录后基因调控中起重要作用。 RNA结合蛋白涉及病毒基因表达（Ray和Das，2002）和微小RNA介导的基因调控（Poria等人，2016）。这里我们描述了（1）通过紫外线交联共价连接瞬时相互作用的RNA蛋白复合物的方案，（2）通过RNA酶消化去除未保护的RNA，（3）通过SDS-PAGE分析检测RNA-蛋白复合物。该方案提供了一种快速可靠的手段来直接测定RNA-蛋白质相互作用及其使用纯化蛋白质的动力学，也有助于鉴定新的RNA-蛋白质相互作用
背景 RNA-蛋白质相互作用由瞬时非共价相互作用介导，例如RNA和蛋白质分子中特异残基之间的静电相互作用和氢键。短波UV辐射可以诱导两个紧密放置的芳环之间的共价键形成。在蛋白质和核酸的含氮碱基中的几个氨基酸中发现芳环结构。因此，使用紫外线照射共价连接RNA和相互作用的蛋白质，从而可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析RNA蛋白复合物。该协议描述了一种简单快速的测定系统，可以在体外测定RNA-蛋白质相互作用及其结合动力学。此外，通过该方法获得的荧光标记的RNA-蛋白复合物的质谱分析可以导致新型RNA-蛋白质相互作用的鉴定。
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