| A Highly Sensitive Anion Exchange Chromatography Method for Measuring cGAS Activity in vitro
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a pattern recognition receptor (PRR) that senses double stranded DNA (dsDNA) in the cytosol and this leads to the activation of stimulator of interferon genes (STING) via the secondary messenger 2’3’-cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP). STING then recruits TANK binding kinase 1 (TBK-1) and this complex can phosphorylate and activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) leading to the induction of type I interferons and other antiviral genes. The cGAS:DNA complex catalyzes the synthesis of 2’3’-cGAMP and the purpose of the protocol presented here is to measure the in vitro activity of purified cGAS in the presence of dsDNA. The protocol was developed to elucidate the relationship between dsDNA length and the level of cGAS activity. The method involves an in ...
[摘要] 环状GMP-AMP合酶（cGAS）是一种模式识别受体（PRR），可以感知胞质溶胶中的双链DNA（dsDNA），并通过第二信使2'3'来激活干扰素基因刺激物（STING）。环GMP-AMP（2'3'-cGAMP）。然后STING募集TANK结合激酶1（TBK-1），该复合物可磷酸化并激活干扰素调节因子3（IRF3），导致I型干扰素和其他抗病毒基因的诱导。 cGAS：DNA复合物催化2'3'-cGAMP的合成，这里提出的方案的目的是测量在dsDNA存在下纯化的cGAS的体外>活性。开发该方案是为了阐明dsDNA长度与cGAS活性水平之间的关系。该方法涉及与低浓度cGAS和dsDNA的体外>反应，然后使用阴离子交换色谱法定量反应产物。当比较不同DNA片段激活cGAS的能力时，低浓度的cGAS和dsDNA以及该测定的高灵敏度是关键优势。
【背景】细胞胞质内存在双链DNA是DNA或逆转录病毒感染的潜在迹象。核苷酸转移酶cGAS作为感知细胞溶质dsDNA的模式识别受体起作用。 cGAS被dsDNA变构激活并催化ATP和GTP转化为环状二核苷酸2'3'-cGAMP（或简称cGAMP）（Ablasser et al。>，2013; Civril et al 。>，2013; Diner et al。>，2013; Gao et al。>，2013; ...
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| Murine Pharmacokinetic Studies
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Murine pharmacokinetics (PK) represents the absorption, distribution, metabolism, and elimination of drugs from the body, which helps to guide clinical studies, ultimately resulting in more effective drug treatment. The purpose of this protocol is to describe a serial bleeding protocol, obtaining blood samples at six time points from single mouse to yield a complete PK profile. This protocol has proved to be rapid, highly repeatable, and relatively easy to acquire. Comparing with the conventional PK studies, this method not only dramatically reduces animal usage, but also decreases sample variation obtained from different animals.
[摘要] 小鼠药代动力学（PK）代表了体内药物的吸收，分布，代谢和消除，这有助于指导临床研究，最终导致更有效的药物治疗。 该方案的目的是描述连续出血方案，在单个小鼠的六个时间点获得血液样品以产生完整的PK谱。 该协议已被证明是快速的，高度可重复的，并且相对容易获得。 与传统的PK研究相比，该方法不仅大大减少了动物的使用，而且减少了从不同动物获得的样本变异。
【背景】Pharmacokinetic，来自古希腊药物“药物”和kinetikos“运动”，研究身体如何处理药物。 体内>小鼠PK研究对于确保化合物在临床前药理学和毒性研究中具有适当的PK特性至关重要。可以在血液，血浆，尿液或其他易于取样的流体中测量药物浓度。然而，体内> PK研究传统上是低通量实验：每个化合物6-12个末端血液样品一式三份，每个研究需要18-36只小鼠。高动物使用和劳动密集型采样是这种常规检测的主要障碍。随着生物分析方法灵敏度的提高，已经报道了增加PK的努力，包括使用盒式给药（Berman et al。>，1997，Korfmacher et al。>， 2001），Snapshot PK方法（Liu et al。>，2008）以及最近的Fast PK（Reddy et ...
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| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
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