| Nab Escaping AAV Mutants Isolated from Mouse Muscles
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Neutralizing antibodies (Nabs) are a major challenge in clinical trials of adeno-associated virus (AAV) vector gene therapy, because Nabs are able to inhibit AAV transduction in patients. We have successfully isolated several novel Nab-escaped AAV chimeric capsids in mice by administrating a mixture of AAV shuffled library and patient serum. These AAV chimeric capsid mutants enhanced Nab evasion from patient serum with a high muscle transduction efficacy. In this protocol, we describe the procedures for selection of the Nab-escaped AAV chimeric capsid, including isolation and characterization of Nab-escaping AAV mutants in mice muscle.
[摘要] 中和抗体（Nabs）是腺相关病毒（AAV）载体基因治疗的临床试验中的主要挑战，因为Nab能够抑制患者中的AAV转导。 我们已经成功地分离了几种新型Nab逃逸的AAV嵌合衣壳，通过给予AAV混洗库和患者血清的混合物。 这些AAV嵌合衣壳突变体增强了来自患有高肌肉转导功效的患者血清的Nab逃避。 在该协议中，我们描述了选择Nab逃逸的AAV嵌合衣壳的程序，包括在小鼠肌肉中分离和鉴定Nab逃逸的AAV突变体。
【背景】腺相关病毒（AAV）载体已被用于许多临床前研究和临床试验。使用AAV基因疗法已经接受了许多疾病的最终治疗。然而，在未来的临床试验中，循环中的中和抗体的存在对AAV载体的应用提出了主要挑战。已经探索过许多方法来逃避Nab的活动。在此，我们描述了从AAV改组库中选择Nab逃逸突变体的定向进化方法。
DNA改组是产生不同突变体的强大策略。通过连续几轮的表型选择，DNA改组文库的特点是质量更高，目标多样化。来自AAV改组文库的衣壳突变体的高通量选择已被用作探索具有靶向特定组织和逃避Nabs的能力的AAV突变体的有前途的策略。然而，大多数这些选择方法只是在体外测试;一些研究甚至使用了兔抗AAV2血清或人静脉注射免疫球蛋白。体内选择衣壳突变体的方法可以提供产生更有效的AAV突变体的平台，所述AAV突变体不仅从患者血清中逃脱Nab，而且增强特定组织中的转导。 ...
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| Endpoint or Kinetic Measurement of Hydrogen Sulfide Production Capacity in Tissue Extracts
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Hydrogen sulfide (H2S) gas is produced in cells and tissues via various enzymatic processes. H2S is an important signaling molecule in numerous biological processes, and deficiencies in endogenous H2S production are linked to cardiovascular and other health complications. Quantitation of steady-state H2S levels is challenging due to volatility of the gas and the need for specialized equipment. However, the capacity of an organ or tissue extract to produce H2S under optimized reaction conditions can be measured by a number of current assays that vary in sensitivity, specificity and throughput capacity. We developed a rapid, inexpensive, specific and relatively high-throughput method for quantitative detection of H2S ...
[摘要] 通过各种酶法在细胞和组织中产生硫化氢（H 2 S）。 H 2 S是许多生物过程中重要的信号分子，内源性H 2 S生产的缺陷与心血管和其他健康并发症有关。稳态H 2 S水平的定量是由于气体的挥发性和专门设备的需要而具有挑战性的。然而，器官或组织提取物在优化的反应条件下产生H 2 S的能力可以通过许多灵敏度，特异性和通过能力变化的现有测定来测量。我们开发了用于从生物组织定量检测H 2 S生产能力的快速，廉价，特异性和相对高通量的方法。释放到生物样品上方的头部空间中的H 2 S 2与乙酸铅反应形成硫化铅，其使用平板阅读器或作为终点测定法连续测量。
【背景】通过哺乳动物（CGL，CBS，3-MST）中的至少三种不同的酶以一定范围的组织和细胞类型分布内源性地产生硫化氢（H 2 S）。 H 2 S作为与代谢相关的广泛生物学功能的气体发射器和效应分子（Wang，2012）起作用（Módiset al。，2013），应力抵抗（Hine等人，2015）和氧化还原生物学（Dickhout et al。，2012）。减少的H 2 S与心血管问题有关，包括啮齿动物中的高血压（Yang等人，2008）和人心脏肥大（Polhemus等人， ，2014）。增加的H 2 S也可引起病理学，例如啮齿动物胰腺炎（Bhatia et al。，2005）。因此，从生物来源准确和定量地检测H 2 ...
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| Luminescence-based Antiviral Assay for Hepatitis E Virus
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Date:
2014-08-05
[Abstract] Hepatitis E virus (HEV) is one of the main causes of acute hepatitis worldwide. Infections are particularly severe in pregnant women and chronic hepatitis E is known to occur in immunocompromised patients. Current therapy (ribavirin or pegylated alpha interferon) has severe side effects and cannot be employed in all patients. In order to evaluate potential new inhibitors of HEV replication, a luminescence-based replicon assay is particularly useful since it offers a rapid read-out and does not pose any biosafety risks (Debing et al., 2014).
[摘要] 戊型肝炎病毒（HEV）是全世界急性肝炎的主要原因之一。 感染在孕妇中特别严重，已知慢性戊型肝炎发生在免疫受损的患者中。 目前的治疗（利巴韦林或聚乙二醇化α干扰素）具有严重的副作用，不能用于所有患者。 为了评价潜在的新的HEV复制抑制剂，基于发光的复制子测定法是特别有用的，因为其提供了快速读出，并且不会引起任何生物安全风险（Debing等人，2014） 。
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