| Isolation, Purification and Characterization of Exosomes from Fibroblast Cultures of Skeletal Muscle
|
|
Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Exosomes are dynamic nanovesicles secreted by virtually all cells and are present in all biological fluids. Given their highly heterogeneous content exosomes have been implicated in many physiological and pathological processes that they exert by influencing cell-cell and cell-ECM communication. In recent years an increasing number of methods have been established for the purification and characterization of exosomes. These include ultracentrifugation, ultrafiltration, size exclusion chromatography, immune capture and precipitation using a proprietary polymer. Here, we provide a protocol based on differential ultracentrifugation and sucrose density gradients tailored for the isolation of crude and ultra-pure exosomes from primary fibroblast cultures derived from adult mouse skeletal ...
[摘要] [摘要 ] 外来体是几乎所有细胞分泌的动态纳米囊泡，并存在于所有生物体液中。鉴于它们的异质含量很高，外泌体已牵涉到它们通过影响细胞-细胞和细胞-ECM通讯而发挥的许多生理和病理过程。近年来，已经建立了越来越多的方法外泌体的纯化和表征。其中包括超速离心，超滤，尺寸排阻色谱，免疫捕获和使用专有聚合物的沉淀。在这里，我们提供了基于差分超速离心和蔗糖密度梯度的协议，该协议专门用于从成年小鼠骨骼肌衍生的原代成纤维细胞培养物中分离粗制和超纯外泌体。可以对该协议进行修改和修改，以从各种组织和体液中分离和表征外泌体。
背景 ] ë xosomes是单膜，异质纳米囊泡直径范围从30至150nm，secre 由所有细胞和存在于几乎所有的体液泰德。外泌体中存在的可溶性和膜大分子，mRNA，microRNA的光谱取决于代谢状态以及分泌这些纳米囊泡的细胞的发育起源。由于它们的货物组成，外泌体可以启动接收细胞中的信号传导途径，并参与了发育，免疫和正常组织生理的维持。在神经退行性疾病，纤维化和癌症等疾病条件下，它们被证明可以触发和传播病理刺激（Rackov 等，2018; Gurunathan 等，2019; van de Vlekkert 等，2019）。在这里，我们描述了从成年小鼠腓肠肌（GA）肌肉建立的成纤维细胞培养物中纯化外泌体的方案（van de Vlekkert ...
|
|
|
| Accurate, Streamlined Analysis of mRNA Translation by Sucrose Gradient Fractionation
|
|
Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] The efficiency with which proteins are produced from mRNA molecules can vary widely across transcripts, cell types, and cellular states. Methods that accurately assay the translational efficiency of mRNAs are critical to gaining a mechanistic understanding of post-transcriptional gene regulation. One way to measure translational efficiency is to determine the number of ribosomes associated with an mRNA molecule, normalized to the length of the coding sequence. The primary method for this analysis of individual mRNAs is sucrose gradient fractionation, which physically separates mRNAs based on the number of bound ribosomes. Here, we describe a streamlined protocol for accurate analysis of mRNA association with ribosomes. Compared to previous protocols, our method incorporates internal ...
[摘要] 从mRNA分子产生蛋白质的效率可以在转录本，细胞类型和细胞状态之间广泛变化。准确测定mRNA翻译效率的方法对获得对转录后基因调控的机理理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与mRNA分子相关的核糖体的数目，归一化为编码序列的长度。分析单个mRNA的主要方法是蔗糖梯度分级，其基于结合核糖体的数目物理分离mRNA。在这里，我们描述了精确分析与核糖体的mRNA相关性的简化方案。与以前的方案相比，我们的方法结合内部控制和改进的缓冲条件，共同减少由非特异性mRNA - 核糖体相互作用引起的伪像。此外，我们的直接分数qRT-PCR方案消除了从梯度部分中RNA纯化的需要，这大大减少了所需的手动时间量，并促进了多个条件或基因靶标的并行分析。此外，在该过程中不产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究S-HAC1 mRNA的翻译抑制状态。但是我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的适应程序。
【背景】将mRNA翻译成蛋白质是一种高度调节的过程，其可以以不同的速率发生，这取决于基因，细胞环境或环境。翻译起始，延伸和终止的每个步骤可以是最终影响与mRNA相关的核糖体数量的调节点（Dever和Green，2012; ...
|
|
|
| Multicolor Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy to Generate High-resolution Images of Respiratory Syncytial Virus Particles and Infected Cells
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Human respiratory syncytial virus (RSV) infection in human lung epithelial A549 cells induces filopodia, cellular protrusions consisting of F-actin, that extend to neighboring uninfected cells (Mehedi et al., 2016). High-resolution imaging via stimulated emission depletion (STED) microscopy revealed filamentous RSV particles along these filopodia, suggesting that filopodia facilitate RSV cell-to-cell spread (Mehedi et al., 2016). In this protocol, we describe how to fix, permeabilize, immunostain, and mount RSV-infected A549 cells for STED imaging. We show that STED increases resolution compared to confocal microscopy, which can be further improved by image processing using deconvolution software.
[摘要] 人肺上皮A549细胞中的呼吸道合胞病毒（RSV）感染诱导丝状伪足，由F-肌动蛋白组成的细胞突起，延伸至相邻的未感染细胞（Mehedi等，2016）。 通过受激发射耗尽（STED）显微镜的高分辨率成像显示沿着这些丝状伪足的丝状RSV颗粒，表明丝状伪足有助于RSV细胞对细胞的扩散（Mehedi等，2016）。 在本协议中，我们描述如何修复，渗透，免疫染色和挂载RSV感染的A549细胞进行STED成像。 我们显示与共聚焦显微镜相比，STED增加了分辨率，可以通过使用去卷积软件的图像处理进一步改进。
【背景】RSV形成多形性病毒颗粒，其长度大约为直径约100nm，长度大约为10μm（Bachi和Howe，1973; Mehedi等，2016）。高分辨率光学显微技术是可视化RSV感染细胞和病毒颗粒之间相互作用的关键。在最近的一项研究中，我们使用超分辨率荧光显微镜来研究人肺上皮A549细胞中的RSV细胞对细胞的扩散。
STED显微镜是超分辨率显微镜技术之一，已被开发以规避约200nm衍射屏障的光限制（Hell和Wichmann，1994; Westphal等人，2008）。 ...
|
|
|