| High Resolution Melting Temperature Analysis to Identify CRISPR/Cas9 Mutants from Arabidopsis
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] CRISPR/Cas9 made targeted mutagenesis and genome editing possible for many plant species. One of the ways that the endonuclease is used for plant genetics is the creation of loss-of-function mutants, which typically result from erroneous DNA repair through non-homologous end joining (NHEJ) pathway. The majority of erroneous repair events results in single-bp insertion or deletion. While single-bp insertions or deletions (indels) effectively destroy the function of protein-coding genes through frameshift, detection is difficult due to the small size shift. High-resolution melting temperature analysis allows quick detection, and it does not require any additional pipetting steps after the PCR amplification of the region of interest. In this protocol, we will describe the steps required for ...
[摘要] CRISPR / Cas9可以对许多植物物种进行定向诱变和基因组编辑。 内切核酸酶用于植物遗传学的方法之一是产生功能丧失突变体，其通常由通过非同源末端连接（NHEJ）途径的错误DNA修复引起。 大多数错误的修复事件导致单bp插入或缺失。 虽然单bp插入或缺失（插入缺失）通过移码有效地破坏蛋白质编码基因的功能，但由于小的移位，检测很困难。 高分辨率熔解温度分析允许快速检测，并且在PCR扩增感兴趣区域后不需要任何额外的移液步骤。 在该方案中，我们将描述分析潜在的纯合突变体所需的步骤。
【背景】CRISPR / Cas9核酸酶是一种核糖核蛋白，能够在特定的22个核苷酸序列上切割DNA双链。与其他核酸酶（例如锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN））相比，CRISPR / Cas9系统的主要优点在于序列特异性由RNA赋予，并且不需要针对每种靶序列的单独蛋白质。这大大降低了成本，单个构造可以定位多达32个目标。由于这种低成本和高效率，CRISPR / Cas9系统现在广泛用于许多植物物种（Baltes和Voytas，2015; Belhaj et al。，2015）。
当CRISPR / Cas9诱导的双链DNA断裂被NHEJ途径错误修复时，修复的序列最常导致小插入缺失，其中一个bp插入缺失是最常见的（Ma et al。，2015; ...
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| Isolation of Genomic DNA from Chlamydomonas reinhardtii
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Author:
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2018-05-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is a soil-dwelling eukaryotic green alga that is widely used as a laboratory model organism for research on photosynthesis, ciliary biology, lipid metabolism and many other aspects of cell biology and physiology. With sequenced nuclear, chloroplast and mitochondrial genomes, Chlamydomonas is also an excellent organism for genetics and genomics research. This protocol describes the isolation of genomic DNA from Chlamydomonas using a standard phenol:chloroform extraction method followed by ethanol precipitation. The protocol requires minimal lab materials, takes approximately 4 h to complete, and can also be used for isolation of genomic DNA from other eukaryotic green algae.
[摘要] 莱茵衣藻是一种土壤居住的真核绿藻，广泛用作实验室模型生物，用于光合作用，睫状生物学，脂质代谢以及细胞生物学和生理学的许多其他方面的研究。 随着核，叶绿体和线粒体基因组的测序，衣藻也是遗传学和基因组学研究的优秀生物。 该协议描述了使用标准酚：氯仿提取方法然后乙醇沉淀从衣藻（Chlamydomonas）中分离基因组DNA。 该协议需要最少的实验室材料，大约需要4小时才能完成，也可用于从其他真核绿藻中分离基因组DNA。
【背景】分离核酸是克隆和测序遗传物质的关键第一步，为从基因表达到基因进化等各种分子生物学研究提供了基础。存在许多用于从藻类中分离DNA的方案（Weeks等人，1986; Fawley和Fawley，2004; HwangBo等人，2010）。通常，通过离心沉淀细胞并在含有去污剂如SDS的缓冲液中裂解以溶解膜。随后在苯酚：氯仿中提取至少一次，并在氯仿中提取至少一次。在一些情况下，进行RNA酶处理步骤以降解RNA。然后通过加入乙醇或异丙醇沉淀DNA，并在冰上或在冰箱中孵育。沉淀并洗涤沉淀的DNA后，通常将其重悬于水或缓冲液（例如Tris-EDTA）中，并在260nm处通过分光光度法定量。
本文所述的方案利用两次苯酚/氯仿/异戊醇萃取和两次氯仿/异戊醇萃取，其间具有RNase处理步骤。在有机溶剂中加入异戊醇可防止起泡并稳定含有高浓度凝固蛋白的界面。重要的是，该协议产生高质量的基因组DNA，适用于下游应用，如克隆和测序。 ...
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| Quantification of Colibactin-associated Genotoxicity in HeLa Cells by In Cell Western (ICW) Using γ-H2AX as a Marker
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The genotoxin colibactin is produced by several species of Enterobacteriaceae. This genotoxin induces DNA damage, cell cycle arrest, senescence and death in eukaryotic cells (Nougayrède et al., 2006; Taieb et al., 2016). Here we describe a method to quantify the genotoxicity of bacteria producing colibactin following a short infection of cultured mammalian cells with colibactin producing E. coli.
[摘要] 基因毒素colibactin由几种肠杆菌科产生。 该基因毒素在真核细胞中诱导DNA损伤，细胞周期停滞，衰老和死亡（Nougayrède等人，2006; Taieb等人，2016）。 在这里，我们描述了一种方法来量化生产colibactin的细菌的基因毒性，在短时间感染培养的哺乳动物细胞后，产生e colibactin。大肠杆菌。
【背景】基因毒素colibactin是由几种肠杆菌科产生的聚酮化合物非核糖体肽杂交化合物。由编码在54kb基因组基因座pks岛上的机器合成的这种毒素在真核细胞中诱导DNA损伤，细胞周期停滞，衰老和死亡（Nougayrède等人， 2006年; Taieb 等人，2016年）。大肠杆菌素的基因毒性活性取决于直接的宿主细胞 - 细菌相互作用，并且不能从培养物上清液，杀死的细菌或细菌裂解物而非生命细菌重演。可以通过量化巨细胞病表型（对于方案参见Bossuet-Greif等人，2017）或双链DNA断裂的定量来评估对真核细胞的大肠杆菌素基因毒性效应的可视化和定量在彗星试验（揭示DNA片段化）或H2AX组蛋白磷酸化作用宿主细胞核中，双链DNA标记断裂。组蛋白H2AX的磷酸化表征为对遗传毒性剂的早期和敏感反应（Audebert等人，2010）。证明H2AX磷酸化比彗星试验在体外以及体内灵敏度高10-100倍（Audebert等人， ...
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