| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites.
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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| In vitro Assays for Measuring Endothelial Permeability by Transwells and Electrical Impedance Systems
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Vascular leakage is an important feature in several diseases, such as septic shock, viral hemorrhagic fever, cancer metastasis and ischemia-reperfusion injuries. Thus establishing assays for measuring endothelial permeability will provide insight into the establishment or progression of such diseases. Here, we provide transwell permeability assay and electrical impedance sensing assay for studying endothelial permeability in vitro. With these methods, the effect of a molecule on endothelial permeability could be defined.
[摘要] 血管渗漏是脓毒性休克，病毒性出血热，癌症转移和缺血再灌注损伤等几种疾病的重要特征。因此，建立测定内皮通透性的测定将提供对这些疾病的建立或进展的洞察。在这里，我们提供transwell渗透性测定和用于研究体内内皮通透性的电阻抗感测测定。通过这些方法，可以定义分子对内皮通透性的影响。
背景 内皮屏障是一个良好调节的结构，其在正常生理条件下保持对流体和分子的最小和选择性渗透性（Komarova和Malik，2010）。内皮屏障的破坏在暴露于炎性细胞因子，病原体感染或癌症转移中发生，其诱导细胞骨架，细胞 - 细胞连接或细胞与基质附着的破坏。血管通透性的增加是许多疾病的重要特征，包括缺血再灌注损伤，败血症，病毒性出血热和癌症。为了筛选哪个分子调节血管通透性，有必要建立体外的体外试验以在扩张到动物研究之前测试内皮通透性。有两种可用的体外试验体外渗透性试验，transwell渗透性测定法和电阻抗检测装置（Bischoff等，2016）。 ...
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| ACE-score-based Analysis of Temporal miRNA Targetomes During Human Cytomegalovirus Infection Using AGO-CLIP-seq
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Date:
2016-04-20
[Abstract] Although temporal regulation of gene expression during the course of infection is known to be critical for determining the outcome of host-virus interactions, systematic temporal analysis of the miRNA targetomes during productive viral infection has been technically challenging due to the large range of miRNA-mRNA cross-talks at the host-virus interface. High-confidence quantifying models of the suppression efficacy in targeting sites by integrating bioinformatics with Argonaute-crosslinking and immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (AGO-CLIP-seq) (Chi et al., 2009) data have been poorly developed. To accurately identify miRNA target sites and calculate the targeting efficacy of miRNA-target interactions, we developed a new bioinformatic quantitation method, ...
[摘要] 尽管已知在感染过程中基因表达的时间调节对于确定宿主 - 病毒相互作用的结果是至关重要的，但是在生产性病毒感染期间对miRNA targetomes的系统时间分析在技术上是具有挑战性的，因为大范围的miRNA- mRNA在主机 - 病毒接口交叉对话。数据通过将生物信息学与Argonaute-交联和免疫沉淀接着高通量测序（AGO-CLIP-seq）数据（Chi等人，2009）数据结合，已经不发达。为了准确地鉴定miRNA靶位点并计算miRNA-靶相互作用的靶向效果，我们开发了新的生物信息学定量方法，即AGO-CLIP-seq富集（ACE） - 评分算法（Kim等， 2015）。在我们的AGO-CLIP-seq分析中包括未感染的对照可以显着提高病毒或人miRNA的真实靶位点识别的准确性，并且在我们的ACE评分方法中提取生产性人巨细胞病毒（HCMV）感染期间的生理学显着变化。因此，我们建议我们新的基于ACE评分的方法可以应用于各种miRNA targetome研究，这将在其他类型的时间背景下进行，如发展阶段，细胞因子或病原体的免疫刺激和其他病毒。
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