| Isolation of Exosomes from Semen for in vitro Uptake and HIV-1 Infection Assays
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Exosomes are membranous extracellular nanovesicles of endocytic origin. Exosomes are known to carry host and pathogen-derived genomic, proteomic, lipidomic cargos and other extraneous molecules. Exosomes are secreted by diverse cell types into the extracellular milieu and are subsequently internalized by recipient neighboring or distal cells. Upon internalization, exosomes condition recipient cells by donating their cargos and/or activating various signal transduction pathways, consequently regulating physiological and pathophysiological processes. Exosomes facilitate intercellular communication, modulate cellular phenotype, and regulate microbial pathogenesis. We have previously shown that semen exosomes (SE) inhibit HIV-1 replication in various cell types. Here, we describe detailed ...
[摘要] 外来体是内膜起源的膜性胞外纳米囊。 已知外来载体携带宿主和病原体衍生的基因组，蛋白质组，脂质体载体和其他外来分子。 外来体由不同细胞类型分泌到细胞外环境中，随后被受体相邻细胞或远端细胞内化。 在内化后，外来体通过捐赠其载体和或激活各种信号转导途径来调节受体细胞，从而调节生理和病理生理过程。 外来体促进细胞间通讯，调节细胞表型和调节微生物发病机制。 我们以前表明精液外来体（SE）抑制各种细胞类型的HIV-1复制。 在这里，我们描述特征SE的详细协议。 该方案可以适应或修改，并用于评估感兴趣的其他细胞外小泡。
外来体是由许多细胞类型的晚期内体室内的内体膜向内发生的结果而引起的膜状纳米囊（Simons and Raposo，2009）。外来体被许多细胞类型（Iglesias等人，2012）释放到细胞外环境中，并且被发现在包括血液在内的生物流体中（Kaur等人，2014）尿（Liem等人，2013）唾液（Madison等人，2015）和母乳（Madison等人，2014; Naslund ，2014）。人类精液含有由包括前列腺分泌腺泡细胞在内的男性生殖道组织产生的纳米囊泡的异质群体（Madison等人，2014; Madison等人，2015） （Sahlen等人，2002）和附睾上皮细胞（Frenette等人，2010）以及vasa感染，睾丸和囊泡腺细胞（ ...
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| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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| Mouse CD8+ T Cell Migration in vitro and CXCR3 Internalization Assays
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Chemokines are molecules that regulate the positioning of cells during homeostasis and inflammation. CXCL10 is an interferon-induced chemokine that attracts cells that express the chemokine receptor CXCR3 on their surface. CXCL10 expression is often induced upon inflammation and guides lymphocytes, such as T and NK cells, into the injured tissues. Notably, CXCL10 binding to CXCR3 induces receptor internalization and, therefore, low CXCR3 levels in cells positive for CXCR3 expression can be indicative of chemokine signaling.
Here, we describe an in vitro method to evaluate the ability of murine CD8+ T cells to migrate towards recombinant murine CXCL10; and a flow cytometry assay to measure CXCR3 expression levels at the surface of T cells, after exposure to ...
[摘要] 趋化因子是调节体内平衡和炎症期间细胞定位的分子。 CXCL10是干扰素诱导的趋化因子，其吸引在其表面上表达趋化因子受体CXCR3的细胞。 CXCL10表达通常在炎症诱导并引导淋巴细胞如T和NK细胞进入受损组织。值得注意的是，CXCL10与CXCR3结合诱导受体内化，因此CXCR3表达阳性细胞中的CXCR3水平降低可能是趋化因子信号传导的指示。
＆nbsp;这里，我们描述体外方法来评估鼠CD8 + T细胞向重组鼠CXCL10迁移的能力;以及暴露于不同剂量的趋化因子后在T细胞表面测量CXCR3表达水平的流式细胞术测定。
背景 趋化因子介导的T细胞运输是稳态和炎症期间的重要过程。活化的CD8 + T细胞表达趋化因子受体，例如CXCR3，允许它们向趋化因子CXCL9,10和11迁移，通常在损伤组织上上调。调节T细胞迁移的分子线索的评估对于了解其功能背后的生物学非常重要，但是在体内运行的复杂机制有时难以去卷积。在这里，我们提供有关体外方法的详细信息，以评估CD8 + T细胞上的趋化因子功能，重点是CXCL10介导的化学吸引和CXCR3内化。我们使用可以容易地在体外扩增和活化的抗原特异性转基因CD8 +细胞，因此提供足够数量的表型相同的淋巴细胞（例如， ...
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