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Author:
Date:
2013-11-20
[Abstract] Protein phosphorylation plays a central role in signal transduction in bacteria. However, separation and detection of the phosphorylated protein from its nonphosphorylated form remain challenging. Here we describe a method to detect phosphorylation of the Bordetella pertussis response regulator BvgA, which is phosphorylated at an aspartate residue (Boulanger et al., 2013). This method is based on the proprietary adduct, Phos-tagTM, a dinuclear metal complex, which together with Zn2+ or Mn2+, forms a complex with a phosphomonoesterdianion, such as the phosphorylated aspartate of a response regulator (Barbieri and Stock, 2008; Kinoshita and Kinoshita-Kikuta, 2011). For in vivo detection, B. pertussis cells are lysed in ...
[摘要] 蛋白质磷酸化在细菌的信号转导中起着中心作用。然而，从其非磷酸化形式分离和检测磷酸化蛋白仍然是挑战性的。在这里我们描述了检测百日咳博德特氏菌响应调节剂BvgA的磷酸化的方法，其在天冬氨酸残基被磷酸化（Boulanger等人，2013）。该方法基于专有的加合物Phos-tag TM sup/TM，其是双核金属络合物，其与Zn 2+或Mn 2+反应， ，与磷酸二酯酶形成复合物，例如应答调节剂的磷酸化天冬氨酸（Barbieri和Stock，2008; Kinoshita和Kinoshita-Kikuta，2011）。对于体内检测，在4℃下在轻度甲酸中裂解百日咳细胞以使磷酸 - 天冬氨酸键的破坏最小化，并且通过包含Phos标签的电泳（SDS-PAGE）将磷酸化的BvgA从其非磷酸化形式分离> TM 。随后通过蛋白质印迹分析检测两种形式的BvgA。还容易实现在体外用乙酰磷酸盐处理后形成的磷酸化BvgA的水平的量化。因此，该技术允许容易地评估B中BvgA磷酸化的水平。百日咳和 。大肠杆菌在不同实验室条件下在体内或在不同反应条件下在体外磷酸化后（本研究部分由NIH的Intramural Research Programme支持， NIDDK）。
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