| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
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| Microvesicle Isolation from Rat Brain Extract Treated Human Mesenchymal Stem Cells
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Microvesicle (MVs) are submicron-sized membranous vesicles that are either actively released from cells via secretory compartments or shed from cell surface membranes. MVs are generated by many cell types and serve as vehicles that transfer biological information (e.g., protein, mRNA, and miRNA) to distant cells, thereby affecting their gene expression, proliferation, differentiation, and function. Although their physiological functions are not clearly defined, recent studies have shown their therapeutic potential for tissue repair and regeneration. While MVs can be isolated readily from mesenchymal stem cells (MSCs) and other cell types from various sources, the yield of MVs under conventional culture condition in vitro is one of the limiting factors for both the in ...
[摘要] 微囊泡（MV）是亚微米尺寸的膜泡囊，其通过分泌室从细胞中积极释放或从细胞表面膜脱落。 MV由许多细胞类型产生并且用作将生物信息（例如，蛋白质，mRNA和miRNA）转移到远端细胞的载体，从而影响其基因表达，增殖，分化和功能。 虽然他们的生理功能没有明确定义，但最近的研究已经显示出其组织修复和再生的治疗潜力。 虽然MV可以从间充质干细胞（MSC）和来自各种来源的其他细胞类型容易地分离，但在体外常规培养条件下MV的产量是限制因素之一， 功能研究以及体外分析分析。 在这里，我们提供了一个通过大鼠脑提取物预处理MSC增加微泡产量的方案。
【背景】通过直接重编程或利用间充质干细胞进行细胞替代治疗来产生神经干细胞或神经细胞是神经变性疾病的潜在选择（Adib等人，2015）。最近的研究已经证明，来自MSC的微泡代表了增强组织再生，例如神经元再生，免疫调节，脑损伤中的血管发生的其他细胞替代方法的新颖且安全的替代方案（Kim等人，2013） ; Porro等，，2015; Lee等人，2016）。对受损组织外源信号如何影响微泡数量和组成的了解甚少。 MSCs的功能分泌物的含量和数量可以根据微环境的显着变化（Qu等人，2007）。例如，已知缺血性脑提取物或缺氧诱导合成有益于组织再生过程的许多细胞因子和生长因子（Chen等，2007; Shin et ...
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| In Gel Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Proper spatiotemporal regulation of protein phosphorylation in cells and tissues is required for normal development and homeostasis. We present the protocol ‘In Gel Kinase Assay’, which is useful for protein kinase activity measurements from crude protein extracts. We have successfully used ‘In Gel Kinase Assay’ protocol to show that the Arabidopsis thaliana sextuple mutant in the PYRABACTIN RESISTANCE1/PYR1-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS (PYR/PYL/RCAR-ABA receptors; line pyr/pyl112458) is impaired in ABA-mediated activation of SnRK2.2, SnRK2.3 and OST1/SnRK2.6, as much as the triple mutant snrk2.2/2.3/2.6 (Gonzalez-Guzman et al., 2012).
[摘要] 正常发育和体内平衡需要细胞和组织中蛋白质磷酸化的适时时空调节。我们提出方案“凝胶激酶测定”，其可用于粗蛋白质提取物的蛋白激酶活性测量。我们已经成功地使用“凝胶激酶测定”方案来证明在ABA受体（PYR / PYL / RCAR-ABA受体）的PYRABACTIN RESISTANCE1 / PYR1-样/调节组分中的拟南芥线条pyr / pyl112458 ）在ABA介导的SnRK2.2，SnRK2.3和OST1 / SnRK2.6的活化中受损，多达三重突变体snrk2.2 / 2.3 / 2.6 （Gonzalez-Guzman等人，2012）。
背景 植物激素脱落酸（ABA）是涉及植物生长发育以及植物对非生物和生物胁迫的反应的关键信号。 ABA感知和信号通路由ABA受体（PYR / PYL / RCAR-ABA受体）的PYRABACTIN RESISTANCE1 / PYR1-调节组分，PP2C磷酸酶和SnRK2s激酶组成（在Antoni等人， ，，2011）。模块受体-ABA-磷酸酶通过调节ABA激活的SnRK2而以配体依赖的方式控制磷酸化信号级联。反过来，SnRK2s激酶使细胞核和细胞质中的无数效应物从转录因子（例如，ABFs）到离子通道（例如）磷酸化， ...
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