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OptiPrepTM Density Gradient Medium

OptiPrep TM密度梯度培养基

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: D1556
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Mammalian Cell-derived Vesicles for the Isolation of Organelle Specific Transmembrane Proteins to Conduct Single Molecule Studies
Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract]  Cell-derived vesicles facilitate the isolation of transmembrane proteins in their physiological membrane maintaining their structural and functional integrity. These vesicles can be generated from different cellular organelles producing, housing, or transporting the proteins. Combined with single-molecule imaging, isolated organelle specific vesicles can be employed to study the trafficking and assembly of the embedded proteins. Here we present a method for organelle specific single molecule imaging via isolation of ER and plasma membrane vesicles from HEK293T cells by employing OptiPrep gradients and nitrogen cavitation. The isolation was validated through Western blotting, and the isolated vesicles were used to perform single molecule studies of oligomeric receptor assembly. [摘要]  细胞衍生的囊泡促进跨膜蛋白在其生理膜中的分离,从而维持其结构和功能完整性。 这些囊泡可以由产生,容纳或运输蛋白质的不同细胞器产生。 结合单分子成像,可以使用分离的细胞器特异性囊泡来研究嵌入蛋白质的运输和组装。 在这里,我们提出了一种通过使用OptiPrep梯度和氮气穴通过从HEK293T细胞中分离ER和质膜囊泡来进行细胞器特异性单分子成像的方法。 通过Western印迹验证分离,并使用分离的囊泡进行寡聚受体组装的单分子研究。

【背景】大量的跨膜蛋白通过多个亚基的组装形成,导致复杂的寡聚结构,其可以通常以多种化学计量存在。了解组装中的变化如何改变在不同细胞器中的贩运和本地化对于确定蛋白质的生理作用以及与成熟和运输相关的疾病的连接至关重要。单分子方法可以通过直接测量其化学计量比来更好地理解寡聚蛋白的组装(Ulbrich和Isacoff,2007; Richards等人,2012)。这种方法避免了整体平均,从而提供了所有化学计量的平均状态(Walter and Bustamante,2014)。单分子研究近来已被用于理解大分子的结构和功能特性,包括构象动力学(Tan等人,2014),离子通道门控(Wang等人 ,2016),配体 - 受体相互作用(Moonschi等人,2015)和化学计量组装(Ulbrich和Isacoff,2007; ...

Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract]  The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers. [摘要]  该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I(PC1)载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜,胞质溶胶,纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备,反应的组装,以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II(COPII)在从内质网(ER)途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现,并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用(Novick 1981; Kaiser等人,1990; Barlowe等人,1994)。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用(Kim等人,2005)。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm,似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I(PC1)三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异,COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的(Boyadjiev等人,2006)。最近,我们报道了通过随机光学重建显微镜(STORM),相关光电子显微镜(CLEM)和活细胞成像(Gorur ...

Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract]  Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content. [摘要]  细胞外囊泡(EVs)通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车,但是它们最近才被孤立,并且关于它们的生物发生,释放,摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里,我们提出了一个详细的方案,用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV,以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡(EVs)是介导蛋白质,脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力,对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究,以及生物流体的增长列表(Colombo等,2014)。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用,但比较缺乏(An et al。,2007; Davis et al。,2016)。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
  虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到,使用透射电子显微镜,但直到2009年才开发出分离方法(Halperin和Jensen,1967)。 ...

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