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Magnesium chloride

氯化镁

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: M8266
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Other protocol()

Metal-tagging Transmission Electron Microscopy for Localisation of Tombusvirus Replication Compartments in Yeast
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract]  Positive-stranded (+) RNA viruses are intracellular pathogens in humans, animals and plants. To build viral replicase complexes (VRCs) viruses manipulate lipid flows and reorganize subcellular membranes. Redesigned membranes concentrate viral and host factors and create an environment that facilitates the formation of VRCs within replication organelles. Therefore, efficient virus replication depends on the assembly of specialized membranes where viral macromolecular complexes are turned on and hold a variety of functions. Detailed characterization of viral replication platforms in cells requires sophisticated imaging approaches. Here we present a protocol to visualize the three-dimensional organization of the tombusvirus replicase complex in yeast with MEtal-Tagging Transmission Electron ... [摘要]  正链(+)RNA病毒是人,动物和植物中的细胞内病原体。构建病毒复制酶复合物(VRC)病毒操纵脂质流动和重组亚细胞膜。重新设计的膜集中了病毒和宿主因子,并创造了促进复制细胞器内VRC形成的环境。因此,有效的病毒复制取决于病毒大分子复合物开启并具有各种功能的特殊膜的组装。细胞中病毒复制平台的详细特征需要复杂的成像方法。在这里我们提出一个协议,用肉眼标记透射电子显微镜(METTEM)可视化酵母中的tombusvirus复制酶复合物的三维组织。该协议使我们能够用METTEM和电子断层扫描成像三维病毒复制酶分子的细胞内分布。我们的研究显示病毒复制酶分子如何在特化细胞膜内构建复制复合物。

【背景】正链RNA病毒的复制取决于细胞膜的重塑。细胞内膜作为VRC装配的结构支架,提供调节病毒复制酶活性和保护病毒RNA免受宿主抗病毒防御的必需脂质和辅因子(Miller和Krijnse-Locker,2008; den Boon <等,2010; nagy和pogany,2011;="" nagy,2016)。电子显微镜观察到具有活性vrc的复制细胞器的结构。="" vrc以单个膜囊或'小球',管状球形立方体膜,双膜囊泡(dmv)或平面寡聚体阵列装配(de="" castro等人,2013)。通常在rna病毒感染的细胞中观察到小球。它们通过在各种细胞器中内陷而形成,并具有对胞质溶胶的狭窄开口(den="" boon="" et=""> ...

Purification of RNA Mango Tagged Native RNA-protein Complexes from Cellular Extracts Using TO1-Desthiobiotin Fluorophore Ligand
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  A native purification strategy using RNA Mango for RNA based purification of RNA-protein complexes is described. The RNA Mango aptamer is first genetically engineered into the RNA of interest. RNA Mango containing complexes obtained from cleared cellular native extracts are then immobilized onto TO1-Desthiobiotin saturated streptavidin agarose beads. The beads are washed to remove non-specific complexes and then the RNA Mango containing complexes are eluted by the addition of free biotin to the beads. Since the eluted complexes are native and fluorescent, a second purification step such as size exclusion chromatography can easily be added and the purified complexes tracked by monitoring fluorescence. The high purity native complexes resulting from this two-step purification strategy can ... [摘要]  描述了使用RNA Mango进行RNA-蛋白质复合物的RNA纯化的天然纯化策略。 RNA芒果适体首先被基因工程改造成感兴趣的RNA。 然后将从清除的细胞天然提取物获得的含有RNA复合物的复合物固定在TO1-Desthiobiotin饱和的链霉亲和素琼脂糖珠上。 洗涤珠粒以去除非特异性复合物,然后通过向珠粒中加入游离生物素来洗脱含RNA芒果的复合物。 由于洗脱的复合物是天然的和荧光的,所以可以容易地添加第二纯化步骤如尺寸排阻色谱,并且通过监测荧光追踪纯化的复合物。 通过这种两步纯化策略产生的高纯度天然复合物可以用于进一步的生物化学表征。

【背景】目前的RNA标签受限于诸如差K ,大尺寸,潜在的生物学干扰或缺乏固有荧光的限制(Panchapakesan等人, 2015年)。 RNA芒果很小,可以简单地整合到茎环结构中,特别是GNRA tetraloops中,它具有生物耐受性,并且最重要的是对其噻唑橙基(TO1)配体TO1-Desthiobiotin(TO1-Dtb)具有高亲和力。 ...

Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq. [摘要]  基因表达在多个水平上动态调节,包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件,我们描述了我们用净化细胞核(INTACT)纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA,所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。

【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用,每种方法都有其优点和缺点(Bailey-Serres,2013年综述)。分离特定的调控区室,如细胞核(来自细胞器,核糖体,细胞质,等等)可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里,我们描述了一种方法,可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核,适用于研究核基因表达的实验(例如,核RNA的RNA-Seq,ATAC-Seq,ChIP -Seq,等。)。此外,我们描述了RNA的处理,导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织(日本野生稻栽培品种日本晴)(Reynoso等人,2018年)一起使用,但是它们基于以前开发的方案, (拟订和Henikoff,2010年和2011年)和番茄(罗恩等人,2014年)。

该协议的第一部分,INTACT方法(用于标记特定细胞类型的核的分离)允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域,GFP和生物素连接酶识别肽(BLRP)组成的三联核标签融合蛋白(NTF)的细胞类型特异性表达实现的。 ...

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