| Confocal and Super-resolution Imaging of RNA in Live Bacteria Using a Fluorogenic Silicon Rhodamine-binding Aptamer
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Genetically encoded light-up RNA aptamers have been shown to be promising tools for the visualization of RNAs in living cells, helping us to advance our understanding of the broad and complex life of RNA. Although a handful of light-up aptamers spanning the visible wavelength region have been developed, none of them have yet been reported to be compatible with advanced super-resolution techniques, mainly due to poor photophysical properties of their small-molecule fluorogens. Here, we describe a detailed protocol for fluorescence microscopy of mRNA in live bacteria using the recently reported fluorogenic silicon rhodamine binding aptamer (SiRA) featuring excellent photophysical properties. Notably, with SiRA, we demonstrated the first aptamer-based RNA visualization using super-resolution ...
[摘要] [摘要 ] 遗传编码的点亮适体是显示活细胞中RNA的有前途的工具，可帮助我们加深对RNA广泛而复杂的生命的理解。可见光波长区已经被开发，他们都没有然而，据报道，在兼容先进的超分辨率技术，主要是由于不良的光物理性质其小分子荧光团。在这里，我们描述了一个详细的协议对于荧光显微镜mRNA的使用最近报道的具有优异光物理性质的荧光罗丹明结合适体（SiRA ）在活细菌中进行检测。值得注意的是，我们利用SiRA 展示了首个使用超分辨率（STED）显微镜进行的基于适体的RNA可视化。这种成像方法可能特别有价值用于可视化原核生物中的RNA，因为细菌的大小仅比光学分辨率大几倍 传统显微镜的分辨率。
[背景 ] 可视化的具体RNA分子通过荧光显微镜具有不可估量的价值在过去二十年中扩大我们的知识RNA功能内的细胞在时空精气神（特亚吉，2009年;夏等人，2017年），由于缺乏。固有的荧光RNA，用于活细胞成像的荧光RNA标记工具的开发以及它们对最新显微镜的适应性 –特别是对于超分辨率显微镜– 势在必行。超分辨率显微镜（SRM）对于原核系统中的RNA成像特别有吸引力，因为细菌很小（〜2.5MYU中号长，0.5-1〜MYU 中号宽）和分辨率的标准荧光显微镜被限制在200〜300〜牛米，由于衍射极限光（Reshes ...
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| Non-radioactive LATS in vitro Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] This protocol describes a method to directly measure LATS activity by an in vitro kinase assay using YAP as a substrate.
[摘要] 该方案描述了通过使用YAP作为底物的体外激酶测定直接测量LATS活性的方法。
【背景】大肿瘤抑制剂1/2（LATS1 / 2）是河马途径的蛋白激酶和核心成分，其调节器官大小和组织稳态。 LATS激酶通过其疏水基序上的磷酸化被激活（HM，对于LATS1为Thr 1079，对于LATS2为Thr 1041）。 结果，在HM中识别LATS的抗体抗体的Western印迹提供了评估LATS激酶活性的间接方法（Data analysis，图1）。 此外，活性LATS在Ser 127磷酸化并抑制转录共激活物是相关蛋白（YAP），导致YAP结合到14-3-3和细胞质保留（Zhao等人，2007）。 在LATS体外激酶测定中使用YAP作为底物提供了直接评估LATS激酶活性的方法。 通过该测定，我们能够显示血清饥饿和山梨醇诱导的渗透激活LATS（Yu等人，2012; Hong等人，2017）和进一步的 导致YAP Ser 127磷酸化（数据分析，图2）。
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| Cell Fractionation of Pseudomonas aeruginosa
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Author:
Date:
2013-10-05
[Abstract] Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium. Separating the cell envelope compartments enables proteins to be localized to confirm where in the cell they function. Cell fractionation can also provide a first step in a protein purification strategy (Williams et al., 1998). This protocol has been designed to obtain the different fractions of P. aeruginosa, namely the inner membrane, outer membrane, cytoplasmic and periplasmic compartments. Specific detection of the arginine specific autotransporter (AaaA) (Luckett et al., 2012) in the outer membrane of P. aeruginosa has been performed using this protocol.
[摘要] 铜绿假单胞菌是革兰氏阴性细菌。 分离细胞包膜区室使得蛋白质能够被定位以确认它们在细胞中的何处起作用。 细胞分级还可以提供蛋白质纯化策略的第一步（Williams等人，1998）。 该方案已经设计成获得不同比例的P。 铜绿假单胞菌，即内膜，外膜，细胞质和周质区室。 在P的外膜中特异性检测精氨酸特异性自转运体（AaaA）（Luckett等人，2012）。 已经使用该协议进行了铜绿假单胞菌。
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