| High-level Production of Recombinant Membrane Proteins Using the Engineered Escherichia coli Strains SuptoxD and SuptoxR
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] We have previously described the development of two specialized Escherichia coli strains for high-level recombinant membrane protein (MP) production. These engineered strains, termed SuptoxD and SuptoxR, are capable of suppressing the cytotoxicity caused by MP overexpression and of producing greatly enhanced MP yields. Here, we present a Bio-protocol that describes gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these strains.
[摘要] [摘要] 我们之前已经描述了两种用于生产高水平重组膜蛋白（MP）的大肠杆菌菌株的开发。这些工程菌株，称为SuptoxD和SuptoxR，能够抑制MP过度表达引起的细胞毒性，并产生显著提高的MP产量。在这里，我们提出一个生物协议，描述基因过度表达和培养条件，最大限度地积累膜整合和折叠良好的重组多磺酸粘多糖在这些菌株。
[背景]多磺酸粘多糖在所有活生物体的细胞中执行多种关键功能（Wagner et al.，2006；Schlegel et al.，2010），是当前和未来药物的主要靶点（Yildrim et al.，2007）。获得足够数量的分离蛋白是进行生化和结构研究的前提，这反过来又可以加深对其功能的理解，并发现新的MP靶向药物。
由于多磺酸粘多糖通常在其天然环境中以极低的丰度出现，异源宿主通常用于其重组过表达和随后的纯化。许多不同的系统已被用作原核和真核来源的多种多磺酸粘多糖的过表达宿主（Wagner等人，2006年）。其中，大肠杆菌是最受欢迎的一种，因为它的成本非常低，使用方便（Makino等人，2011年）。事实上，这种细菌已经成功地用于生产储存在蛋白质数据库中的所有重组产生的MP结构的大约20%（Dilworth等人，2018年）。尽管有这些优势和成功，但使用大肠杆菌作为MP生产的异源宿主通常伴随着严重的毒性、低水平的最终生物量和微小的最终产量（Miroux和Walker，1996；Wagner等人，2007；Link等人，2008；Gubellini等人，2011）。 ...
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| Phagocytosis Assay for α-Synuclein Fibril Uptake by Mouse Primary Microglia
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Microglia are professional phagocytes in the brain and deficiency in their phagocytic activity plays an important role in Parkinson’s disease. This protocol mainly describes the phagocytosis assay for uptake of α-synuclein preformed fibrils, a pathologic form of α-synuclein, by primary microglia.
[摘要] 小胶质细胞是大脑中的专业吞噬细胞，其吞噬活性的缺乏在帕金森病中起重要作用。 该方案主要描述了通过原代小胶质细胞摄取α-突触核蛋白预先形成的原纤维（α-突触核蛋白的病理形式）的吞噬作用测定。
【背景】作为大脑的免疫细胞，小胶质细胞在中枢神经系统中起着关键作用。在生理状态下，小胶质细胞不断探索周围环境并参与突触修剪。小胶质细胞可被任何类型的病理事件或脑内稳态的变化激活（Wolf et al。，2017）。激活后，小胶质细胞经历形态学变化，增殖，分泌炎性细胞因子，迁移至病变部位，吞噬病原体，病细胞，碎片，甚至细胞外蛋白质聚集体（Kettenmann et al。，2011; Fu et al。，2014）。 α-突触核蛋白是神经元中的丰富蛋白质，并且是帕金森病中称为路易体和路易神经突的神经元内包涵体的主要成分（Luk 等人，，2012）。最近的研究表明α-突触核蛋白经历细胞间扩散，小胶质细胞是α-突触核蛋白的主要清除剂，它可能承担来自神经元的α-突触核蛋白的负担（Wolf et al。，2017 ）。在这里，我们描述了使用人α-突触核蛋白单体产生预先形成的原纤维并通过小胶质细胞吞噬作用测量α-突触核蛋白预先形成的原纤维的摄取的方案（Du et al。，2017）。
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| RNA Immunoprecipitation (RIP) Sequencing of Pri-miRNAs Associated with the Dicing Complex in Arabidopsis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] RNA immunoprecipitation (RIP) is an antibody-based technique used to map in vivo RNA-protein interactions. DBR1, an RNA debranching enzyme, is responsible for the debranching of lariat RNA, for the degradation and turnover of lariat RNAs. It is well known that primary miRNA (Pri-miRNA) is recognized and further processed into mature miRNA by the Dicing complex mainly composed of DCL1 and HYL1. Due to the low abundance of pri-miRNAs, RIP followed qRT-PCR has been widely used to evaluate the binding efficiency of the Dicing complex with pri-miRNAs in previous studies. Therefore, the genome-wide evaluation of the Dicing complex with pri-miRNAs is lacking. With the improvement of high-throughput sequencing technologies, we successfully used RIP-seq to compare the binding efficiency ...
[摘要] RNA免疫沉淀（RIP）是一种基于抗体的技术，用于绘制体内 RNA-蛋白质相互作用。 DBR1是一种RNA脱支酶，负责套索RNA的脱支，用于套索RNA的降解和转换。众所周知，主要miRNA（Pri-miRNA）被主要由DCL1和HYL1组成的切割复合物识别并进一步加工成成熟miRNA。由于pri-miRNA的丰度较低，RIP随后的qRT-PCR已被广泛用于评估切割复合物与pri-miRNA在先前研究中的结合效率。因此，缺乏对具有pri-miRNA的切割复合物的全基因组评估。随着高通量测序技术的改进，我们成功地使用RIP-seq比较了Dicing复合物与野生型和 dbr1-2 突变体之间的pri-miRNA的结合效率。 。在该方案中，我们提供了在两种不同基因型之间的HYL1-YFP和DCL1-YFP转基因植物中使用GFP捕获珠的RIP-seq的详细描述。该方法可用于评估pri-miRNA与拟南芥中的切割复合物的结合，并且它可以应用于植物中的其他RNA结合蛋白。
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