| Chromatin Affinity Purification (ChAP) from Arabidopsis thaliana Rosette Leaves Using in vivo Biotinylation System
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Chromatin Affinity Purification (ChAP) is widely used to study chromatin architecture and protein complexes interacting with DNA. Here we present an efficient method for ChAP from Arabidopsis thaliana rosette leaves, in which in vivo biotinylation system is used. The chromatin is digested by Micrococcal Nuclease (MNase), hence the distribution of nucleosomes is also achieved. The in vivo biotinylation system was initially developed for Drosophila melanogaster (Mito et al., 2005), but the presented protocol has been developed specifically for Arabidopsis thaliana (Sura et al., 2017).
[摘要] 染色质亲和纯化（ChAP）被广泛用于研究染色质结构和与DNA相互作用的蛋白质复合物。 在这里，我们提出了一种有效的从拟南芥莲座叶中ChAP的方法，其中使用了体内生物素化系统。 染色质被Micrococcal核酸酶（MNase）消化，因此核小体的分布也被实现。 体内生物素化系统最初是为黑腹果蝇而开发的（Mito et al。2005），但是所提出的方案是专门为 拟南芥（Sura et。，2017）。
【背景】染色质免疫沉淀（ChIP）成为研究染色质结构和组织的最重要和最常用的技术之一。但是，它需要高质量的抗体，不会与非特异性靶标发生交叉反应。在含有细胞壁并富含光合作用相关化合物和蛋白质的植物中，这是相当难以实现的，这些化合物和蛋白质经常引起交叉反应性问题。另一方面，获得稳定的转基因生物是植物常规和容易的策略。由于这些原因，大多数植物研究人员选择基因标签，获得融合蛋白，并用ChIP替代方法即染色质亲和纯化（ChAP）来研究染色质。 ChAP技术已被证明在植物染色质研究中非常有效（Zentner和Henikoff，2014）。此外，它通常比经典ChIP便宜，因为它不需要产生抗体，并且通常比ChIP更有效，因为标签以比直接针对感兴趣的蛋白质产生的抗体更高的亲和力被识别。 ...
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| Generation of Busulfan Chimeric Mice for the Analysis of T Cell Population Dynamics
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] This protocol was developed to generate chimeric mice in which T lymphocytes could be stratified by age on the basis of congenic marker expression. The conditioning drug busulfan is used to ablate host haematopoietic stem cells while leaving the peripheral immune system intact. Busulfan treatment is followed by bone marrow transplantation (BMT), with T-cell depleted donor bone marrow bearing a different congenic marker (CD45.2) to that of the host mouse (CD45.1). New cell production post-BMT can thus be tracked by measuring the fraction of CD45.2+ cells over time within a population of interest (Hogan et al., 2015; Gossel et al., 2017).
[摘要] 该方案被开发用于生成嵌合小鼠，其中T淋巴细胞可以根据同基因标志物表达的年龄进行分层。 白藜芦醇调理药物用于消融宿主造血干细胞，同时使外周免疫系统保持完整。 接受白消安治疗的是骨髓移植（BMT），T细胞耗竭的供体骨髓携带与宿主小鼠（CD45.1）不同的同基因标记（CD45.2）。 因此可以通过在感兴趣的群体内随时间测量CD45.2 +细胞的比例来追踪新的细胞生成后BMT（Hogan等人，2015; Gossel ，2017）。
【背景】骨髓嵌合体是研究免疫系统发育和功能的有价值的工具。典型地，通过照射宿主小鼠然后用供体骨髓移植产生嵌合体。辐射对造血系统造成相当大的损害，并且完全免疫重建在移植后延迟数周至数月（Fry和Mackall，2005）。由此产生的淋巴细胞减少期促使幼稚T细胞的自发性增殖和获得类似记忆的表型（Goldrath等人，2004）。为了避免辐射引起的免疫稳态的紊乱，我们把注意力转向调理药物白消安。白消安是一种烷化剂，对造血干细胞（HSC）有毒性，但不会耗竭循环淋巴细胞（Westerhof等人，2000; Hsieh等人，2007） 。在白消安调理和骨髓移植（BMT）之后，嵌合体与未处理的对照没有区别：它们具有正常数量的幼稚和记忆CD4和CD8T细胞，并且这些细胞表达增殖标记Ki67的正常水平（Hogan等人。，2015; Gossel ...
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| End-synapsis Assay
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Author:
Date:
2013-09-20
[Abstract] Many environmental agents induce double-strand breaks (DSBs) in DNA. Unrepaired or improperly repaired DSBs can lead to cell death or cancer. Nonhomologous end joining is the primary DNA double-strand break repair pathway in eukaryotes. During NHEJ pathway, several proteins recognize and bind DNA ends, bring the ends in a synaptic complex and, finally, process and ligate the ends.
Briefly, NHEJ starts with Ku protein. Ku binds the broken DNA ends and recruits the catalytic subunit of DNA dependent protein kinase (DNA-PKcs) forming DNA-PK. After processing, the XRCC4/Ligase IV complex executes the final ligation stimulated by Cernunnos-XLF.
Here, we describe an end-synapsis assay. This assay can be used in order to delineate which proteins are necessary to bring the ...
[摘要] 许多环境因素诱导DNA中的双链断裂（DSB）。未修复或不正确修复的DSB可导致细胞死亡或癌症。非同源末端连接是真核生物中的主要DNA双链断裂修复途径。在NHEJ途径期间，几种蛋白质识别和结合DNA末端，将末端引入突触复合物，最后进行处理并连接末端。
简言之，NHEJ起始于Ku蛋白。 Ku结合断裂的DNA末端，并招募形成DNA-PK的DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PKcs）的催化亚基。处理后，XRCC4 /连接酶IV复合物执行Cernunnos-XLF刺激的最终连接。
在这里，我们描述一种末端突触检测。可以使用该测定法来描绘在NHEJ期间将DNA末端置于稳定突触复合物中所必需的蛋白质。简言之，来自人细胞的NHEJ感受态提取物与结合链霉抗生物素蛋白包被的磁珠和相同的可溶性放射性标记片段的双链DNA片段一起温育。然后将微珠在温和的盐缓冲液中洗涤，并通过闪烁计数测量用珠回收的放射性。没有提取物或无DNA珠的对照实验平行进行以确定非特异性背景。
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