In vitro NLK Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions to perform an in vitro kinase assay for nemo-like kinase. In addition, this protocol also describes an efficient method using mild lysis buffer for expression and purification of Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins.
[摘要] 该协议提供了一步一步的指导,以进行nemo样激酶的体外激酶测定。 此外,该方案还描述了使用温和裂解缓冲液来表达和纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白的有效方法。
【背景】果蝇nemo已经被确定为在发育中的果蝇眼中光感受器簇的关键调节剂(Choi和Benzer,1994)。 据报道,nemo是不同物种间保守的。 该哺乳动物同系物是类似于Nemo的激酶(NLK)(Brott等人,1998; Rocheleau等人,1999)。 NLK是CMGC集团(CDK,MAPK,GSK3和CLK)的成员,也属于非典型的MAPK家族。 NLK通过转录因子调节多种细胞机制,所述转录因子包括在不同信号传导途径中的关键参与者TCF / LEF1,NICD和FOXO(Ishitani等人,1999; Ishitani等人, ,2010; Kim等人,2010)。 此外,最近我们已经将NLK鉴定为Yes相关蛋白(YAP)的新型激酶,YAP是Hippo途径中的共转录激活剂(Moon等人,2017)。 该协议描述了用于测量类似尼莫地来激酶活性的体外方法。
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Uptake Assays in Xenopus laevis Oocytes Using Liquid Chromatography-mass Spectrometry to Detect Transport Activity
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Xenopus laevis oocytes are a widely used model system for characterization of heterologously expressed secondary active transporters. Historically, researchers have relied on detecting transport activity by measuring accumulation of radiolabeled substrates by scintillation counting or of fluorescently labelled substrates by spectrofluorometric quantification. These techniques are, however, limited to substrates that are available as radiolabeled isotopes or to when the substrate is fluorescent. This prompted us to develop a transport assay where we could in principle detect transport activity for any organic metabolite regardless of its availability as radiolabeled isotope or fluorescence properties.
In this protocol we describe the use of X. laevis oocytes ...
[摘要] 非洲爪蟾卵母细胞是用于表征异源表达的第二活性转运蛋白的广泛使用的模型系统。历史上,研究人员依靠通过闪烁计数或荧光标记的底物通过分光荧光定量测量放射性标记底物的积累来检测运输活动。然而,这些技术仅限于可用作放射性标记的同位素的底物或当底物是荧光时。这促使我们开发了一种运输测定法,我们可以原则上检测任何有机代谢物的转运活性,无论其作为放射性标记的同位素或荧光性质如何。
在这个协议中,我们描述了X的使用。卵母细胞作为表达次要活性转运蛋白的异源宿主,以及如何进行摄取测定,然后通过液相色谱 - 质谱(LC-MS)检测和定量运输的代谢物。我们已经成功地使用这种方法来鉴定和表征称为硫代葡萄糖苷和氰基葡糖苷的植物防御代谢物的转运蛋白(Jørgensen等人,2017),然而该方法可用于表征任何转运蛋白底物可以通过LC-MS检测。
【背景】来自非洲爪蟾蛙(Xenopus laevis)的卵母细胞是用于异源表达和表征膜蛋白(即,转运蛋白和通道)的完整表达系统。 X。卵母细胞表达少量内源性膜蛋白,具有低的背景转运活性。此外,来自植物的次要活性转运蛋白(Boorer等人,1992; Theodoulou和Miller,1995; Nour-Eldin等人,2006),动物(Sumikawa 1981); ...
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Quantitative Determination of Ascorbate from the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii by HPLC
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2016-12-20
[Abstract] Ascorbate (Asc, also called vitamin C) is of vital importance to the cellular functions of both animals and plants. During evolution, Asc has become one of the most abundant metabolites in seed plants; however, Asc contents in cyanobacteria, green algae and bryophytes are very low. Here we describe a sensitive and reliable HPLC method for the quantitative determination of cellular Asc content in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.
[摘要] 抗坏血酸(Asc,也称为维生素C)对动物和植物的细胞功能至关重要。 在进化过程中,Asc已经成为种子植物中最丰富的代谢物之一; 然而,蓝藻,绿藻和苔藓植物中的Asc含量非常低。 在这里,我们描述了一种灵敏可靠的HPLC方法,用于定量测定绿藻衣藻中细胞Asc含量。
背景 针对高等植物开发了用于确定细胞Asc含量的先前方案,其中细胞Asc的量足够高以用于分析。 这些方案不适用于绿色藻类,因为植物材料的量和细胞Asc的水平通常都受到限制。 因此,需要开发一种灵敏度提高到μM范围来测量绿藻中细胞Asc的新方法。
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