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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] In this assay, 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNA 3’ Ends) followed by PE (primer extension), abbreviated as 3’ RACE-PE is used to identify the mRNA 3’ ends. The following protocol describes the amplification of the mRNA 3’ ends at the galactose operon in E. coli and the corresponding visualization of the PCR products through PE. In PE, the definite primer is 5’ end-labeled using [γ-(32) P] ATP and T4 polynucleotide kinase, which anneals to the specific DNA molecules within the PCR product of the 3’ RACE. The conventional PE can only be used to locate the 5’ end of an mRNA transcript since reverse transcriptase (RTase) polymerizes only in the 5’ → 3’ direction. Thus, Taq polymerase is used instead of RTase, PCR is performed. Therefore, we are able to locate the 3’ end of the ...
[摘要] 在该测定中，使用缩写为3'RACE-PE的3'RACE（cDNA3'末端快速扩增），随后是PE（引物延伸），以鉴定mRNA3'末端。以下方案描述E中半乳糖操纵子的mRNA 3'末端的扩增。并通过PE对相应的PCR产物进行可视化。在PE中，使用[γ-（32）P] ATP和T4多核苷酸激酶对确定的引物进行5'末端标记，其退火至3'RACE的PCR产物内的特定DNA分子。由于逆转录酶（RTase）仅在5'→3'方向聚合，常规PE只能用于定位mRNA转录物的5'末端。因此，使用Taq聚合酶代替RTase，进行PCR。因此，我们能够使用此测定法定位mRNA的3'末端。通过在变性8％尿素-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中分离DNA产物，可以直接显示和定量3'末端的相对量。 3'末端的确切位置可以通过比较这些最终的DNA产物与相应的DNA测序阶梯进行测序。
【背景】mRNA 3'末端的合成是E中的重要步骤。产生稳定的信使RNA（mRNA）的大肠杆菌。在真核细胞中，mRNA 3'末端形成是通过从内部磷酸二酯键切割，然后加入聚（A）尾;而在原核细胞中，通过终止转录或通过加工初级转录产生mRNA的3'末端（Altman和Robertson，1973; Nudler和Gottesman，2002; Zhao等人，1999年）。因此，分析mRNA ...
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Author:
Date:
2013-09-05
[Abstract] We describe an efficient method to obtain a sufficient quantity of RNA from nematode-induced galls with a high quality and integrity, proved to be appropriate for transcriptomic analysis, i.e. real time PCR, microarray hybridization or second generation sequencing. This protocol is efficient for small quantities of galls (organs with high protein and sugar contents). The protocol allows obtaining an RNA yield of 5-15 μg total RNA from 250-300 hand dissected galls at 3 days post infection (dpi) (Figure 1). It was proved particularly for Arabidopsis and tomato.
[摘要] 我们描述了一种有效的方法，以高质量和完整性从线虫诱导的gall中获得足够量的RNA，证明适合于转录组分析，即实时PCR，微阵列杂交或第二代测序 。 该方案对于少量胆汁（具有高蛋白质和糖含量的器官）是有效的。 该协议允许在感染后3天（dpi）从250-300个手部解剖的疱疹获得5-15μg总RNA的RNA产量（图1）。 它被证明特别适用于拟南芥和番茄。
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