| A Method for SUMO Modification of Proteins in vitro
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] The Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) is a protein that is post-translationally added to and reversibly removed from other proteins in eukaryotic cells. SUMO and enzymes of the SUMO pathway are well conserved from yeast to humans and SUMO modification regulates a variety of essential cellular processes including transcription, chromatin remodeling, DNA damage repair, and cell cycle progression. One of the challenges in studying SUMO modification in vivo is the relatively low steady-state level of a SUMO-modified protein due in part to the activity of SUMO deconjugating enzymes known as SUMO Isopeptidases or SENPs. Fortunately, the use of recombinant SUMO enzymes makes it possible to study SUMO modification in vitro. Here, we describe a sensitive method for ...
[摘要] 小泛素相关修饰物（SUMO）是一种蛋白质，其翻译后添加到真核细胞中并可逆地从其他蛋白质中去除。 SUMO和SUMO途径的酶从酵母到人类都很保守，SUMO修饰调节了多种基本细胞过程，包括转录，染色质重塑，DNA损伤修复和细胞周期进程。 研究SUMO修饰体内的挑战之一是SUMO修饰蛋白的相对低的稳态水平，部分原因是SUMO去缀合酶（SUMO Isopeptidases或SENPs）的活性。 幸运的是，使用重组SUMO酶可以在体外研究SUMO修饰。 在这里，我们描述了一种灵敏的方法，用于检测目标人类蛋白质的SUMO修饰，使用来自兔网织红细胞和放射性标记的氨基酸的体外转录和翻译系统。
【背景】与其他泛素蛋白家族修饰一样，SUMO修饰通过ATP依赖性酶促级联发生，涉及E1激活酶（人类中的Aos1 / Uba2异二聚体），E2结合酶（Ubc9）和许多E3连接之一的连续活性。酶（Gareau和Lima，2010）。具有SUMO缀合共有位点的蛋白质ΨKxE（Ψ是疏水残基，其后是赖氨酸，任何氨基酸和谷氨酸），可以通过哺乳动物中表达的一种或几种SUMO旁系同源物（包括SUMO1，SUMO2）进行有效修饰。或SUMO3（统称为SUMO2 / 3，因为它们的序列同源性为97％）（Gareau和Lima，2010; Flotho和Melchior，2013）。 ...
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| In vitro AMPylation Assays Using Purified, Recombinant Proteins
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Post-translational protein modifications (PTMs) orchestrate the activity of individual proteins and ensure their proper function. While modifications such as phosphorylation or glycosylation are well understood, more unusual modifications, including nitrosylation or AMPylation remain comparatively poorly characterized. Research on protein AMPylation–which refers to the covalent addition of an AMP moiety to the side chains of serine, threonine or tyrosine–has undergone a renaissance (Yarbrough et al., 2009; Engel et al., 2012; Ham et al., 2014; Woolery et al., 2014; Preissler et al., 2015; Sanyal et al., 2015; Truttmann et al., 2016; Truttmann et al., 2017). The identification and characterization of filamentation ...
[摘要] 翻译后蛋白质修饰（PTM）协调各种蛋白质的活性并确保其功能正常。虽然诸如磷酸化或糖基化的修饰被很好地理解，但是更不寻常的修饰，包括亚硝基化或AMP化仍然比较差的表征。关于蛋白质AMP化的研究 - 其是将AMP部分共价加成到丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸的侧链，已经经历了复兴（Yarbrough et al。，2009; Engel et al。 2012年; Ham等人，2014年; Woolery等人，2014年; Preissler等人，2015年; ; Sanyal等人，2015; Truttmann等人，2016; Truttmann等人，2017）。鉴定和表征含丝状（fic）结构域的AMPylases引起了对该PTM的新兴趣（Kinch等人，2009; Yarbrough等人，2009）。基于最近的体内和体外研究，我们现在知道分泌的细菌AMPylase共价连接AMP到Rho家族GTP酶的成员，而后生动物AMPylases修饰HSP70家族蛋白在细胞质和内质网（ER）（Itzen等人，2011; Hedberg和Itzen，2015; Truttmann和Ploegh，2017）。认为AMP化学将HSP70置于不能参与蛋白质重折叠反应的引发剂但瞬时失活的状态（Preissler等人，2015）。 ...
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| Analysis of Telomeric G-overhangs by in-Gel Hybridization
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Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] Telomeric DNA in majority of eukaryotes consists of an array of TG-rich tandem repeats. The TG-rich DNA strand is oriented with its 3’ end towards chromosome termini and is usually longer than its complementary CA-rich strand, thus forming 3’ single stranded overhang (G-overhang). G-overhangs arise from incomplete replication of chromosome termini by the lagging strand mechanism and post-replicative nucleolytic processing. The G-overhang is important for telomere protection as it serves as a binding platform for specific proteins and is required for t-loop formation. Hence, structure of telomeric G-overhang is an important indicator of telomere maintenance and functionality. Here we describe a method for analysis of G-overhangs in a model plant Arabidopsis thaliana by in-gel ...
[摘要] 在大多数真核生物中的端粒DNA由富含TG的串联重复阵列组成。富含TG的DNA链以其3'末端朝向染色体末端定向，并且通常比其互补的富含CA的链更长，从而形成3'单链突出端（G突出端）。 G突出由染色体末端的不完全复制通过滞后链机制和复制后核酸水解加工产生。 G突出端对于端粒保护是重要的，因为其用作特异性蛋白质的结合平台并且是t环形成所需的。因此，端粒G突出端的结构是端粒维持和功能的重要指标。在这里我们描述了通过凝胶内杂交技术在模拟植物拟南芥中分析G突出端的方法。该方法允许单链端粒DNA的量的相对定量。短端粒探针放射性标记并在非变性条件下与DNA杂交以特异性检测ssDNA。可以使用在相同凝胶中的变性条件测量总端粒DNA，并且该程序通常在非变性凝胶内杂交之后。 ssDNA的末端性质通过核酸外切酶处理来验证。这种技术最初是在酵母中开发的，现在被用作从人类到植物的多种生物体中的G突出端分析的主要工具。
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