| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use of sensitized emission. Any widefield microscope capable of sensitive single molecule detection of Cy3 and Cy5 should be able to measure FRET in yeast cells. Alternatively, a FRET-FISH method can be ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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| Single-probe RNA FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a single fluorophore to quantify the amount of transcripts inside budding yeast cells. In addition to allowing the quantification of short transcripts or short features of transcripts, this technique ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交（FISH）技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而，许多情况下，如转录本短于200 nt，剪接变异，或创建转录本的替代起始位点，这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此，我们调整了标准FISH方案，以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外，该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号（Raj和Tyagi，2010）。 使用该方案，不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而，在大多数实验中，绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列，可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时，单个探针的检测效率大于50％（Wadsworth等人，2017）。
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| Halo Assay for Toxic Peptides and Other Compounds in Microorganisms
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] We describe an assay for determination of toxicity in S. cerevisiae involving spotting of a toxic peptide on a lawn of yeast cells. This assay may be generalized to determine toxicity of a variety of compounds by substituting a putative toxic compound in place of the peptide. The general protocol may also be used to determine toxicity of any small compound toward another microorganism by replacing S. cerevisiae with the target microbe and modifying growth conditions accordingly.
[摘要] 我们描述了用于测定S中的毒性的测定法。酿酒酵母包括在酵母细胞的菌苔上发现毒性肽。该测定法可以概括为通过用推定的毒性化合物代替肽来测定多种化合物的毒性。一般方案还可以用于通过替换S来确定任何小的化合物对另一种微生物的毒性。酿酒酵母与目标微生物并相应地改变生长条件。
[背景] 二肽/三肽是所有生物体氮，碳和氨基酸的主要来源之一。含有毒性氨基酸残基的合成肽提供了测定酿酒酵母中肽转运和/或利用的实验方法。通过细胞内肽酶或蛋白酶水解内化肽释放毒性残留物，导致在培养皿中铺板的细胞培养板上生长停滞的容易检测的区域（晕轮）。例如，在细胞内水解时，毒性肽Ala-Eth释放乙硫氨酸（Eth），甲硫氨酸拮抗剂干扰氨基酸掺入蛋白质中以及DNA和其它甲基化途径的正常甲基化，从而导致细胞死亡。当点样到酵母细胞的草坪上时，转运的二肽Ala-Eth将抑制生长，并且在含有Eth的有毒肽被点样的区域周围的细胞的细胞壁中形成清晰的"晕"（图1A）。本文描述的用于测定肽中毒性的测定。 （1）可以通过简单地使用推定的有毒化合物代替含有毒性氨基酸的肽来修饰以确定任何底物的毒性，或者（2）其可以被修饰以通过替换S来确定底物对任何微生物的毒性。酿酒酵母在用靶生物的测定中。它是一种简单，廉价和相对快速的方法，用于确定针对特定生物体和所测定的毒性部分修改的底物毒性。
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