| In vitro Reconstitution Assays of Arabidopsis 20S Proteasome
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] The majority of cellular proteins are degraded by the 26S proteasome in eukaryotes. However, intrinsically disordered proteins (IDPs), which contain large portions of unstructured regions and are inherently unstable, are degraded via the ubiquitin-independent 20S proteasome. Emerging evidence indicates that plant IDP homeostasis may also be controlled by the 20S proteasome. Relatively little is known about the specific functions of the 20S proteasome and the regulatory mechanisms of IDP degradation in plants compared to other species because there is a lack of systematic protocols for in vitro assembly of this complex to perform in vitro degradation assays. Here, we present a detailed protocol of in vitro reconstitution assay of the 20S proteasome in Arabidopsis by modifying previously ...
[摘要] [摘要]大多数细胞蛋白的s的降解通过26S在真核生物蛋白酶。但是，内在无序的蛋白质（IDPs）包含大量的非结构化区域，并且内在地不稳定，因此很容易通过不依赖泛素的20S蛋白酶体降解。越来越多的证据最近显示ň植物境内流离失所者的平衡也可以通过20S蛋白酶控制。但是，由于缺乏用于体外分离20S蛋白酶体和降解测定的系统协议，因此我们对植物中IDP和20S蛋白酶体降解的功能和调控机制的研究和理解一直处于婴儿期与其他生物。在这里，我们通过采用和修改先前公开的方法，对拟南芥中20S蛋白酶体进行体外重组测定的详细方案。在此获得20S核心蛋白酶体的主要策略是从26S蛋白酶体中去除19S调节亚基。该协议包括两个主要部分：1）的来自表达表位标记的PAG1稳定的转基因品系20S蛋白酶体亲和纯化，的20S蛋白酶（程序AD）的基本组成部分; 2 ）体外20S蛋白酶体降解测定法（方法E）。我们预计该协议将提供一种简单有效的方法来研究体外20S蛋白酶体降解，并促进植物中蛋白质代谢的研究。
[背景]蛋白质的降解通常是通过真核生物中的蛋白酶体来实现的。整合的26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成：一个或两个末端的19S调节颗粒（RP），用作蛋白酶体激活剂；和20S核心蛋白酶体（CP），执行降解过程。大多数真核蛋白被多聚泛素化并导入26S蛋白酶体进行降解。然而，含有固有蛋白质无序已发现的区域直接通过破坏一个由20S蛋白酶的泛素依赖性降解（本日产等人，2014） ...
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| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant Arabidopsis thaliana. This Bio-protocol contains two parts: first, a detailed description on the procedure of plant AGO/sRNA co-immunopurification and sRNA recovery for Illumina high throughput sequencing ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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