|
Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] More than 30% of the total amount of proteins synthesized in mammalian cells follow the secretory pathway in order to mature and be properly sorted to their final destinations. Among several methodologies that describe live-cell monitoring of vesicles, the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system is a powerful one that allows to visualize cargo trafficking under physiological conditions. The present protocol describes a method to use the RUSH system in live-cell microscopy and a subsequent quantitative analysis of cargo vesicles to dissect protein trafficking. In brief, HeLa cells are transiently transfected with an MMP2-RUSH construct and vesicle trafficking is evaluated by wide-field microscopy, recording videos in 1-min time frames for 45 min. We also present a quantitative ...
[摘要] [摘要]在哺乳动物细胞中合成的蛋白质总量中，有30％以上遵循分泌途径，以成熟并正确分类至其最终目的地。在描述对囊泡进行活细胞监控的几种方法中，使用选择性钩子保留（RUSH ）系统是一种功能强大的系统，可在生理条件下可视化货物运输。本协议描述了一种在活细胞显微镜中使用RUSH系统的方法，以及随后对货物囊泡进行定量分析以剖析蛋白质运输的方法。简而言之，用MMP2-RUSH构建体瞬时转染HeLa细胞，并通过宽视场显微镜评估囊泡运输，在1分钟的时间范围内录制视频45分钟。我们还提出了一种定量方法，可用于鉴定未表征的蛋白质货物的动力学，以及评估更详细的过程，例如ER到高尔基小泡的运输。
图形摘要：
活细胞RUSH：一种监测分泌途径中实时蛋白质运输的工具
[背景技术[ 0002 ]在哺乳动物细胞中合成的蛋白质总量中，超过30％遵循分泌途径（Pfeffer，2010； Boncompain和Weigel，2018）。通过这种途径，蛋白质通过从ER转运并沿着不同的高尔基体堆积而成熟，直到它们到达反式高尔基体网络（TGN），在那里最终将它们分类并包装成小泡，然后将其输送到细胞内的其他细胞器中，或者到细胞外环境（Glick and Luini，2011; Pantazopoulou and ...
|