| Reconstitution of Chromatin by Stepwise Salt Dialysis
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Chromatin, rather than plain DNA, is the natural substrate of the molecular machines that mediate DNA-directed processes in the nucleus. Chromatin can be reconstituted in vitro by using different methodologies. The salt dialysis method yields chromatin that consists of purified histones and DNA. This biochemically pure chromatin is well-suited for a wide range of applications. Here, we describe simple and straightforward protocols for the reconstitution of chromatin by stepwise salt dialysis and the analysis of the chromatin by the micrococcal nuclease (MNase) digestion assay. Chromatin that is reconstituted with this method can be used for efficient homology-directed repair (HDR)-mediated gene edited with the CRISPR-Cas9 system as well as for biochemical studies of chromatin dynamics and ...
[摘要] [摘要]染色质而不是普通的DNA是介导细胞核中DNA定向过程的分子机器的天然底物。染色质可以重新构建d体外b ÿ使用不同的方法。盐渗析法产生的染色质由纯化的组蛋白和DNA组成。这种生物化学纯的染色质非常适合广泛的应用。在这里,我们描述了通过逐步盐透析和通过微球菌核酸酶(MNase)消化测定法对染色质进行分析的染色质重构的简单明了的协议。该复原用该方法染色质,可用于高效同源定向修复(HDR)介导的基因编辑编 使用CRISPR-Cas9系统,以及用于染色质动力学和功能的生化研究。
[背景]真核细胞中的DNA被组织成染色质。因此,理想情况下,DNA定向过程的分析(例如复制,重组,修复和转录)将使用染色质模板而不是纯DNA进行(Kadonaga,2019)。为此,染色质可通过使用ATP依赖性或ATP依赖性方法在体外从纯化的成分中重建(有关综述,请参见Lusser和Kadonaga,2004年)。
在这里,我们描述了染色质重建的特定方法,该方法在我们利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行HDR介导的基因编辑研究中采用了(Cruz-Becerra和Kadonaga,2020年)。在这项工作中,我们发现相对于普通的(裸)DNA供体模板,通过使用染色质供体模板可以增强精确的HDR介导的DNA插入。我们还将这种方法用于染色质的生化分析,包括高迁移性N组(HMGN)蛋白(Rattner等,2009),染色质动力学(Torigoe等,2013),前核小体(Fei)的表征。等人,2015年),以及核小体失稳因子(NDF)(F ...
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| Confocal Microscopy of Reovirus Transport in Living Dorsal Root Ganglion Neurons
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Neurotropic reoviruses repurpose host machinery to traffic over long distances in neuronal processes and access distal replication sites. Understanding mechanisms of neuronal transmission is facilitated by using simplified in vitro primary neuronal culture models. Advances in the design of compartmentalized microfluidic devices lend robustness to neuronal culture models by enabling compartmentalization and manipulation of distinct neuronal processes. Here, we describe a streamlined methodology to culture sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia of embryonic rats in microfluidic devices. We further describe protocols to exogenously label reovirus and image, track, and analyze transport of single reovirus particles in living neurons. These techniques can be adapted to study ...
[摘要] [摘要] 嗜神经性呼肠孤病毒重新利用宿主机器在神经元过程中进行长距离的传输,并进入远端复制部位。简化的体外原代神经元培养模型有助于理解神经元传递机制。室化微流控装置设计的进展使得不同的神经元过程能够被划分和操作,从而为神经元培养模型提供了稳健性。在这里,我们描述了一种在微流控装置中培养胚胎大鼠背根神经节分离的感觉神经元的方法。我们进一步描述了外源性标记呼肠孤病毒的方法,并对单个呼肠孤病毒粒子在活神经元中的转运进行了成像、跟踪和分析。这些技术可应用于研究其他嗜神经病毒的轴突定向转运以及参与信号传导和病理学的神经因子。
[背景]来自不同家族的病毒,包括黄病毒科、疱疹病毒科、小角RNA病毒科和弹状病毒科,突破神经系统的保护屏障,造成严重的疾病和经济负担(Koyuncu等人,2013年;Bohmwald等人,2018年;Tyler,2018年)。哺乳动物正呼肠孤病毒(reovirus,reovirus)属于呼肠孤病毒科,在多种年轻哺乳动物中引起血清型依赖性神经元感染,可导致致命性脑炎(Tyler等人,1986年;Dermody等人,2013年)。呼肠孤病毒没有被两个同心蛋白壳包裹的片段dsRNA基因组包裹,是研究神经系统病毒感染的一种灵活工具(Dermody等人,2013年)。虽然呼肠孤病毒感染的细胞和分子机制已被广泛地利用转化细胞系进行研究,但这些系统并不能捕捉到极化神经元细胞的复杂性。感染神经元的病毒必须在轴突中长距离传播,才能到达复制和释放的远端。为了了解呼肠孤病毒进入神经元和长距离运输的机制,我们最近采用了一些技术来培养原代神经元,并对活细胞中荧光标记的呼肠孤病毒成像(Aravamudhan等人,2020年)。 ...
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