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Date:
2020-11-20
[Abstract] Electron cryotomography (cryo-ET) is an increasingly popular technique to study cellular structures and macromolecules in situ. Due to poor penetration of electrons through thick biological samples, the vitreously frozen samples for cryo-ET need to be thin. For frozen-hydrated cells, such samples can be produced either by cryomicrotomy or cryo-FIB-milling. As a result, a tomogram of such a sample contains information of a small fraction of the entire cell volume, making it challenging to image rare structures in the cell or to determine the distribution of scattered structures. Here, we describe the tools and workflow that we designed to facilitate serial cryomicrotomy, which makes possible the exploration of a larger volume of individual cells at molecular resolution. We ...
[摘要] [摘要]电子冷冻断层摄影术（cryo-ET）是一种越来越流行的原位研究细胞结构和大分子的技术。由于电子穿透较厚的生物样品的穿透性差，冷冻胚胎移植的玻璃化冷冻样品需要很薄。对于冷冻水化细胞，这类样品可以通过冷冻切片或冷冻纤维研磨来制作。因此，这种样本的层析成像图包含了整个细胞体积的一小部分信息，这使得对细胞中稀有结构的成像或确定分散结构的分布具有挑战性。在这里，我们描述了我们设计的工具和工作流程，这些工具和工作流程使得在分子分辨率下探索更大体积的单个细胞成为可能。我们成功地用连续冷冻切片技术定位和成像了位于有丝分裂的酿酒酵母细胞内微管正端的Dam1/DASH复合物。
[背景]在细胞分裂过程中，染色体必须与动粒微管耦合才能成功分离。动粒是一种大分子复合体，负责将染色体连接到动粒微管的动态正端。在出芽酵母酿酒酵母中，Dam1/DASH复合物是与动粒微管相连的动粒的一部分。有许多研究在体外重建动粒亚复合体，以了解其结构和功能（Musacchio和Desai，2017；Hinshaw和Harrison，2018）。这些尝试已经导致了多种模型，表明了动粒是如何运作的。为了在酿酒酵母中测试这些外部动粒模型，我们使用电子冷冻断层摄影术（cryo-ET）在分子分辨率（4-6nm）原位显示酿酒酵母外动粒。
Cryo-ET是一种越来越流行的技术，用于以分子分辨率原位研究细胞结构和大分子（Ng和Gan，2020）。许多早期的冷冻-胚胎移植研究涉及使用厚的生物样本（>500nm），结果是重建低对比度。为了增加重建的对比度，同时保留样本的细胞背景，样本必须更薄，但不能太薄。因此，一个合理的折衷方案是~100nm的厚度。两种主要的方法是冷冻纤维研磨和冷冻切片。低温纤维研磨涉及到使用镓离子溅射生物材料，直到生物样品的薄片状低温层残留（Marko等人，2006年；Hayles等人，2007年；Rigort等人，2010年；Villa等人，2013年；Mahamid等人，2015年；Medeiros等人，2018年）。冷冻切片包括使用金刚石刀将冰冻的水合样本（如细胞糊）切割成薄的冷冻切片（Al-Amoudi等人，2004a和2004b）。每个冷冻切片或冷冻切片仅包含细胞体积的一小部分。然而值得注意的是，与冷冻纤维研磨相比，连续冷冻切片可以使我们以分子分辨率探索更大比例的细胞。这可以通过对同一细胞的多个连续冷冻切片成像来实现。我们在这里设计了一系列的冷冻手术和数据收集工具。我们成功地利用连续冷冻切片和连续冷冻ET对酿酒酵母中的Dam1/DASH复合物进行了定位和成像。我们还探讨了在酵母冷冻切片中尽量减少人工制品的冷冻切片参数。这种方法也被用于研究有丝分裂酵母和减数分裂芽接酵母（Cai ...
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