| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant Arabidopsis thaliana. This Bio-protocol contains two parts: first, a detailed description on the procedure of plant AGO/sRNA co-immunopurification and sRNA recovery for Illumina high throughput sequencing ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| DigiTAG–a RNA Sequencing Approach to Analyze Transcriptomes of Rare Cell Populations in Drosophila melanogaster
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Cell-type specific transcriptional programs underlie the development and maintenance of organs. Not only distinct cell types within a tissue, even cells with supposedly identical cell fates show a high degree of transcriptional heterogeneity. Inevitable, low cell numbers are a major hurdle to study transcriptomes of pure cell populations. Here we describe DigiTAG, a high-throughput method that combines transposase fragmentation and molecular barcoding to retrieve high quality transcriptome data of rare cell types in Drosophila melanogaster. The protocol showcases how DigiTAG can be used to analyse the transcriptome of rare neural stem cells (type II neuroblasts) of Drosophila larval brains, but can also be utilized for other cell types or model systems.
[摘要] [摘要]细胞类型的特定转录程序是器官的发育和维持的基础。不仅组织内不同的细胞类型，甚至具有相同细胞命运的细胞也显示出高度的转录异质性。不可避免的是，低细胞数量是研究纯细胞群体转录组的主要障碍。在这里，我们介绍DigiTAG ，这是一种高通量方法，将转座酶片段化和分子条形码相结合，以检索果蝇中稀有细胞类型的高质量转录组数据。该协议展示了DigiTAG如何可用于分析果蝇幼虫的罕见神经干细胞（II型成神经细胞）的转录组 大脑，但也可以用于其他细胞类型或模型系统。
[背景]在发育过程中，不同细胞类型之间的过渡与组织稳态之间的关系是由大量转录因子及其诱导的转录变化所精心安排的。在过去的十年中，RNA测序（RNA- seq ）已成为测量整个基因组转录动力学的经典方法（Stark等，2019）。组织上的大量RNA序列不允许研究不同细胞群体的转录网络，特别是稀有细胞类型的转录网络。因此，需要提供低输入样品高质量转录组的RNA- seq方案。
在果蝇中，有限的材料通常构成分析特定组织或细胞类型的障碍。果蝇神经干细胞（称为神经母细胞）很好地说明了这一点（Homem和Knoblich ，2012）。存在成神经细胞的几个不同的亚群。例如，在果蝇的幼虫大脑中，只有16种II型成神经细胞产生神经元，神经元支配了运动和感觉处理所需的大脑区域（Walsh and ...
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| Low-cost and High-throughput RNA-seq Library Preparation for Illumina Sequencing from Plant Tissue
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] Transcriptome analysis can provide clues to biological processes affected in different genetic backgrounds or/and under various conditions. The price of RNA sequencing (RNA-seq) has decreased enough so that medium- to large-scale transcriptome analyses in a range of conditions are feasible. However, the price and variety of options for library preparation of RNA-seq can still be daunting to those who would like to use RNA-seq for their first time or for a single experiment. Among the criteria for selecting a library preparation protocol are the method of RNA isolation, nucleotide fragmentation to obtain desired size range, and library indexing to pool sequencing samples for multiplexing. Here, we present a high-quality and a high-throughput option for preparing libraries from ...
[摘要] [摘要] 转录组分析可以为不同遗传背景或不同条件下的生物学过程提供线索。RNA测序（RNA-seq）的价格已经下降到足够低的程度，因此在各种条件下进行中大规模转录组分析是可行的。然而，对于那些希望第一次使用RNA-seq或进行单个实验的人来说，RNA-seq库制备的价格和各种选择仍然是令人望而生畏的。选择文库制备方案的标准包括RNA分离方法、核苷酸片段化以获得所需的大小范围，以及文库索引以汇集测序样本进行多路复用。在这里，我们提出了一个高质量和高通量的选择，从多聚腺苷酸mRNA制备文库用于转录组分析。高质量和高通量的方案选择都包括通过磁珠使poly-A尾部沉淀，cDNA合成，然后通过Tn5介导的“标记”同时裂解和添加适配器的步骤。该方案的所有步骤均已通过拟南芥叶片和幼苗组织的验证，并简化为协同工作，在资金和时间上成本最低，因此旨在为转录组分析提供一个初学者友好的从开始到完成的RNA序列库制备。
[背景] 通过Southern印迹、expressed sequence ...
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