| A Spectrofluorophotometrical Method Based on Fura-2-AM Probe to Determine Cytosolic Ca2+ Level in Pseudomonas syringae Complex Bacterial Cells
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] Calcium signaling is an emerging mechanism by which bacteria respond to environmental cues. To measure the intracellular free-calcium concentration in bacterial cells, [Ca2+]i, a simple spectrofluorometric method based on the chemical probe Fura 2-acetoxy methyl ester (Fura 2-AM) is here presented using Pseudomonad bacterial cells. This is an alternative and quantitative method that can be completed in a short period of time with low costs, and it does not require the induction of heterologously expressed protein-based probes like Aequorin. Furthermore, it is possible to verify the properties of membrane channels involved in Ca2+ entry from the extracellular matrix. This method is in particular valuable for measuring [Ca2+]i in the range of 0.1-39.8 µM in small cells like those of ...
[摘要] [摘要]钙信号传导是细菌对环境线索作出反应的一种新兴机制。为了测量细菌细胞中细胞内游离钙的浓度，在此使用假单胞菌细菌细胞，提出一种基于化学探针Fura 2-乙酰氧基甲基酯（Fura 2-AM）的简单分光荧光法[Ca 2+ ] i 。这是一种可替代的定量方法，可在短时间内以低成本完成，并且不需要诱导异源表达的基于蛋白质的探针（如水母发光蛋白）。此外，有可能验证参与Ca 2+从细胞外基质进入的膜通道的特性。该方法对于在像原核生物一样的小细胞中测量[Ca 2+ ] i在0.1-39.8 µM范围内特别有价值。
[背景] Ca 2+是一种新兴的细菌细胞内信使，会影响多种细胞过程，例如维持细胞完整性，细胞分裂（Dominguez等人，2015），运动性（Tisa和Alder，1995；Gode-Potratz等人，2010；Cruz等人，2012；Guragain等人，2013； Parker等人，2015；Fishman等人，2018 ），III型分泌物（DeBord等人，2003；Dasgupta等人，2003）。 ，2006; Gode-Potratz等，2010; Fi shman等，2018），基因表达（Dominguez等，2015），群体感应（Werthén和Lundgren，2001），生物膜形成（Patrauchan等,, 2001）。 2005年; ...
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| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of other putative polyamine transporters, such as isoforms of the P5B transport ATPases.
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| A One-enzyme RT-qPCR Assay for SARS-CoV-2, and Procedures for Reagent Production
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Given the scale of the ongoing COVID-19 pandemic, the need for reliable, scalable testing, and the likelihood of reagent shortages, especially in resource-poor settings, we have developed an RT-qPCR assay that relies on an alternative to conventional viral reverse transcriptases, a thermostable reverse transcriptase/DNA polymerase (RTX) (Ellefson et al., 2016). Here we show that RTX performs comparably to the other assays sanctioned by the CDC and validated in kit format. We demonstrate two modes of RTX use – (i) dye-based RT-qPCR assays that require only RTX polymerase, and (ii) TaqMan RT-qPCR assays that use a combination of RTX and Taq DNA polymerases (as the RTX exonuclease does not degrade a TaqMan probe). We also provide straightforward recipes for the purification of this ...
[摘要] [摘要]鉴于持续进行的COVID-19大流行的规模，可靠，可扩展的测试需求以及试剂短缺的可能性（尤其是在资源匮乏的环境中），我们开发了一种n RT-qPCR分析方法，该方法依赖于其他方法与常规病毒逆转录酶相比，热稳定的逆转录酶/ DNA聚合酶（RTX）（Ellefson等，2016）。在这里，我们显示RTX与CDC认可并以试剂盒形式验证的其他检测方法具有可比性。我们演示了两种RTX使用模式-（i）仅需要RTX聚合酶的基于染料的RT-qPCR分析，以及（ii）使用RTX和Taq DNA聚合酶组合的TaqMan RT-qPCR分析（因为RTX核酸外切酶不降级ea TaqMan探针）。我们还提供了纯化该替代试剂RTX的简单方法。我们预计，在资源匮乏或需要的地方，研究人员可以获取可用的构建体，并开始开发自己的测定方法，而不论它们存在的调控框架如何。
[背景]尽管已采用多种病毒检测方法来检测SARS-CoV-2感染，包括各种分子诊断和免疫诊断测试，但逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是主要且最敏感的方法SARS-CoV-2检测试验（D'Cruz等，2020 ; Tang等，2020 ）。RT-qPCR的首要地位在很大程度上是因为基于抗体的测试以及快速核酸诊断平台（如Abbott ...
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