| Reconstitution of Chromatin by Stepwise Salt Dialysis
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Chromatin, rather than plain DNA, is the natural substrate of the molecular machines that mediate DNA-directed processes in the nucleus. Chromatin can be reconstituted in vitro by using different methodologies. The salt dialysis method yields chromatin that consists of purified histones and DNA. This biochemically pure chromatin is well-suited for a wide range of applications. Here, we describe simple and straightforward protocols for the reconstitution of chromatin by stepwise salt dialysis and the analysis of the chromatin by the micrococcal nuclease (MNase) digestion assay. Chromatin that is reconstituted with this method can be used for efficient homology-directed repair (HDR)-mediated gene edited with the CRISPR-Cas9 system as well as for biochemical studies of chromatin dynamics and ...
[摘要] [摘要]染色质而不是普通的DNA是介导细胞核中DNA定向过程的分子机器的天然底物。染色质可以重新构建d体外b ÿ使用不同的方法。盐渗析法产生的染色质由纯化的组蛋白和DNA组成。这种生物化学纯的染色质非常适合广泛的应用。在这里，我们描述了通过逐步盐透析和通过微球菌核酸酶（MNase）消化测定法对染色质进行分析的染色质重构的简单明了的协议。该复原用该方法染色质，可用于高效同源定向修复（HDR）介导的基因编辑编 使用CRISPR-Cas9系统，以及用于染色质动力学和功能的生化研究。
[背景]真核细胞中的DNA被组织成染色质。因此，理想情况下，DNA定向过程的分析（例如复制，重组，修复和转录）将使用染色质模板而不是纯DNA进行（Kadonaga，2019）。为此，染色质可通过使用ATP依赖性或ATP依赖性方法在体外从纯化的成分中重建（有关综述，请参见Lusser和Kadonaga，2004年）。
在这里，我们描述了染色质重建的特定方法，该方法在我们利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行HDR介导的基因编辑研究中采用了（Cruz-Becerra和Kadonaga，2020年）。在这项工作中，我们发现相对于普通的（裸）DNA供体模板，通过使用染色质供体模板可以增强精确的HDR介导的DNA插入。我们还将这种方法用于染色质的生化分析，包括高迁移性N组（HMGN）蛋白（Rattner等，2009），染色质动力学（Torigoe等，2013），前核小体（Fei）的表征。等人，2015年），以及核小体失稳因子（NDF）（F ...
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| A Workflow for High-pressure Freezing and Freeze Substitution of the Caenorhabditis elegans Embryo for Ultrastructural Analysis by Conventional and Volume Electron Microscopy
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] The free-living nematode Caenorhabditis elegans is a popular model system for studying developmental biology. Here we describe a detailed protocol to high-pressure freeze the C. elegans embryo (either ex vivo after dissection, or within the intact worm) followed by quick freeze substitution. Processed samples are suitable for ultrastructural analysis by conventional electron microscopy (EM) or newer volume EM (vEM) approaches such as Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). The ultrastructure of cellular features such as the nuclear envelope, chromosomes, endoplasmic reticulum and mitochondria are well preserved after these experimental procedures and yield accurate 3D models for visualization and analysis (Chang et al., 2020). This protocol was used in the 3D ...
[摘要] [摘要]自由生活的线虫秀丽隐杆线虫是研究发育生物学的流行模型系统。在这里，我们描述了详细的协议，以高压冷冻线虫的胚胎（解剖后离体，或完整的蠕虫内），然后快速冷冻替代。经过处理的样品适合通过常规电子显微镜（EM）或更新的体积EM（vEM）方法（如Focuse d离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM））进行超微结构分析。的细胞特征，例如超微结构的NUCL耳信封，染色体，内质网和线粒体保存良好这些实验程序后，并产生精确的三维模型用于可视化和分析（张等人，2020）。在秀丽隐杆线虫合子的前核相遇后，该方案被用于膜和染色体的3D重建（Rahman等，2020）。
[背景技术]线虫是自由生活线虫具有许多特性，使其适合于科学的研究：（1）将蠕虫是〜1毫米长; ...
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| Primer ID Next-Generation Sequencing for the Analysis of a Broad Spectrum Antiviral Induced Transition Mutations and Errors Rates in a Coronavirus Genome
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Next generations sequencing (NGS) has become an important tool in biomedical research. The Primer ID approach combined with the MiSeq platform overcomes the limitation of PCR errors and reveals the true sampling depth of population sequencing, making it an ideal tool to study mutagenic effects of potential broad-spectrum antivirals on RNA viruses. In this report we describe a protocol using Primer ID sequencing to study the mutations induced by antivirals in a coronavirus genome from an in vitro cell culture model and an in vivo mouse model. Viral RNA or total lung tissue RNA is tagged with Primer ID-containing cDNA primers during the initial reverse transcription step, followed by two rounds of PCR to amplify viral sequences and incorporate sequencing adaptors. Purified and pooled ...
[摘要] [摘要]下一代测序（NGS）已成为生物医学研究的重要工具。结合MiSeq平台的Primer ID方法克服了PCR错误的局限性，并揭示了群体测序的真实采样深度，使其成为研究潜在的广谱抗病毒剂对RNA病毒的诱变作用的理想工具。在本报告中，我们描述了一种使用引物ID测序的方案，用于研究体外细胞培养模型和体内小鼠模型中冠状病毒基因组中抗病毒药诱导的突变。在最初的反转录步骤中，病毒RNA或总肺组织RNA用含Primer ID的cDNA引物标记，然后进行两轮PCR扩增病毒序列并整合测序适配器。使用MiSeq平台对纯化和合并的文库进行测序。测序数据使用模板共有序列（TCS）网络应用处理。引物ID方法提供了一种精确的测序方案，可以测量病毒RNA基因组和宿主mRNA中的突变错误率。测序结果表明，β-D-N4-羟基胞嘧啶核苷（NHC）大大提高了病毒RNA基因组中的过渡取代率，但并未显着提高颠覆取代率，并且发现胞嘧啶（C）至尿苷（U）是最常见的突变。
[背景]下一代测序（NGS）已被广泛应用在生物医学研究中使用在过去十年。当应用NGS研究宿主内病毒种群的RNA病毒时，需要考虑对文库制备和测序方案的修改。样本之间的病毒滴度（或病毒载量）差异很大。传统的NGS平台在测序运行中需要1-500 ng的DNA（或RNA），但在大多数情况下，临床样品中的病毒RNA少于100 ...
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