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2-Mercaptoethanol

2-巯基乙醇

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: M6250
Bio-protocol()
Company-protocol()
Other protocol()

Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract]  In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the protein has a tag of six histidines at its amino terminal end. The purified protein possesses a native-like conformation and it is produced in large quantities, around 5-6 mg per liter. [摘要]  在该协议中,我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白(氨基酸384-661)的胞外域的产生和纯化,其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达,但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中,我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化,因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象,并且大量生产,每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒(HCV)是全世界慢性肝炎,肝硬化和肝细胞癌的主要原因(Major et al。,2001; Alter,2006)。此时,没有HCV疫苗,抗病毒药物用于治疗HCV感染(Imran et al。,2014)。然而,治疗费用昂贵且不是100%有效(Kohli et al。,2014)。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用,因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集,先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质,并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子(Flint ...

Identifying Protein Interactions with Histone Peptides Using Bio-layer Interferometry
Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract]  Histone post-translational modifications (PTMs) regulate numerous cellular processes, including gene transcription, cell division, and DNA damage repair. Most histone PTMs affect the recruitment or exclusion of reader proteins from chromatin. Here, we present a protocol to measure affinity and interaction kinetics between histone peptides and the recombinant protein using Bio-layer interferometry. [摘要]  组蛋白翻译后修饰(PTM)调节许多细胞过程,包括基因转录,细胞分裂和DNA损伤修复。 大多数组蛋白PTM影响从染色质中募集或排除读取蛋白。 在这里,我们提出了一个协议,使用生物层干涉测量法测量组蛋白肽和重组蛋白之间的亲和力和相互作用动力学。

【背景】真核染色质结构大致分为常染色质和异染色质(Cheung和Lau,2005),异染色质结构根据组蛋白翻译后修饰(PTM)的组合进一步细分。这些PTM不仅改变染色质构象,还在基因表达和蛋白质募集中建立直接调节作用(Felsenfeld和Groudine,2003; Allshire和Madhani,2017)。组蛋白PTM的无数组合 - 包括乙酰化,磷酸化,甲基化,泛素化,生物素化,SUMO化和脯氨酸异构化,统称为“组蛋白标记” - 可以被发现,特别是在从核小体核心突出的非结构化N末端尾部( Guetg和Santoro,2012)。这些PTM通过不同“读者”或效应蛋白的活动调节许多细胞过程,包括基因转录,细胞分裂和DNA损伤修复(Suganuma和Workman,2011)(Musselman et al。, 2012)。因此,已经做出很大努力来识别读者的组蛋白修饰。

使用常规方法(例如,表面等离子体共振[SPR]和SPR成像[SPRi]生物传感器)研究读取蛋白与其靶蛋白PTM之间的相互作用通常需要大量底物或复杂的多步实验方法并且由于各种方法特定的限制而变得复杂。这些问题排除了量化相互作用强度的简便性和准确性(Phizicky和Fields,1995; ...

Cell Synchronization by Double Thymidine Block
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract]  Cell synchronization is widely used in studying mechanisms involves in regulation of cell cycle progression. Through synchronization, cells at distinct cell cycle stage could be obtained. Thymidine is a DNA synthesis inhibitor that can arrest cell at G1/S boundary, prior to DNA replication. Here, we present the protocol to synchronize cells at G1/S boundary by using double thymidine block. After release into normal medium, cell population at distinct cell cycle phase could be collected at different time points. [摘要]  细胞同步广泛用于研究涉及细胞周期进程调节的机制。 通过同步,可以获得不同细胞周期阶段的细胞。 胸苷是一种DNA合成抑制剂,可在DNA复制前阻止细胞在G1 / S边界。 在这里,我们提出了使用双胸苷阻滞同步G1 / S边界细胞的协议。 释放到正常培养基中后,可以在不同的时间点收集不同细胞周期阶段的细胞群。

【背景】细胞周期和细胞分裂是细胞生物学的核心。为了构建多细胞生物体,细胞复制对于产生可以执行特定功能的特化细胞是必需的。正常细胞周期由间期(G1期,S期和G2期)和有丝分裂期(M期)组成(Rodríguez-Ubreva et al。,2010;Léger et al。 ,2016)。在间期期间,遗传物质被复制并使一切为有丝分裂做好准备。然而,在有丝分裂期,重复的染色体被分离并分配到子细胞中(Sakaue-Sawano 等人,,2008)。

为了精确保存遗传信息,必须严格控制细胞周期进程。细胞周期蛋白/ CDK复合物通过在各自阶段快速促进活动来控制细胞周期进展,并且当它们的阶段完成时迅速失活(Graña和Reddy,1995)。

细胞同步对于研究细胞周期调节事件特别有用。使用不同的方法,细胞可以在不同的细胞周期阶段同步。治疗作为微管形成抑制剂的诺考达唑可以使细胞处于G2 / M期同步(Ho et ...

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