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2-Mercaptoethanol

2-巯基乙醇

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: M6250
Bio-protocol()
Company-protocol()
Other protocol()

Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract]  Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo protein into transport vesicles at the TGN under specific experimental conditions. [摘要]  [摘要] 反式高尔基体网络(TGN)上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质,半完整的哺乳动物细胞和核苷酸,在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定,如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。

[背景] 的反式高尔基体网络(TGN)是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度,真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中,然后运至特定的目的地(Guo 等人,2014)。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解,重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网(ER)将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立(Kim 等,2005; Kim 等,2007; Merte 等,2010; Yuan 等。,2018;Niu 等,2019;)。已经开发出一种体外测定法,其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放(Ponnambalam 等,1996;Wakana ...

Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract]  In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the protein has a tag of six histidines at its amino terminal end. The purified protein possesses a native-like conformation and it is produced in large quantities, around 5-6 mg per liter. [摘要]  在该协议中,我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白(氨基酸384-661)的胞外域的产生和纯化,其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达,但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中,我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化,因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象,并且大量生产,每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒(HCV)是全世界慢性肝炎,肝硬化和肝细胞癌的主要原因(Major et al。,2001; Alter,2006)。此时,没有HCV疫苗,抗病毒药物用于治疗HCV感染(Imran et al。,2014)。然而,治疗费用昂贵且不是100%有效(Kohli et al。,2014)。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用,因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集,先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质,并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子(Flint ...

Identifying Protein Interactions with Histone Peptides Using Bio-layer Interferometry
Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract]  Histone post-translational modifications (PTMs) regulate numerous cellular processes, including gene transcription, cell division, and DNA damage repair. Most histone PTMs affect the recruitment or exclusion of reader proteins from chromatin. Here, we present a protocol to measure affinity and interaction kinetics between histone peptides and the recombinant protein using Bio-layer interferometry. [摘要]  组蛋白翻译后修饰(PTM)调节许多细胞过程,包括基因转录,细胞分裂和DNA损伤修复。 大多数组蛋白PTM影响从染色质中募集或排除读取蛋白。 在这里,我们提出了一个协议,使用生物层干涉测量法测量组蛋白肽和重组蛋白之间的亲和力和相互作用动力学。

【背景】真核染色质结构大致分为常染色质和异染色质(Cheung和Lau,2005),异染色质结构根据组蛋白翻译后修饰(PTM)的组合进一步细分。这些PTM不仅改变染色质构象,还在基因表达和蛋白质募集中建立直接调节作用(Felsenfeld和Groudine,2003; Allshire和Madhani,2017)。组蛋白PTM的无数组合 - 包括乙酰化,磷酸化,甲基化,泛素化,生物素化,SUMO化和脯氨酸异构化,统称为“组蛋白标记” - 可以被发现,特别是在从核小体核心突出的非结构化N末端尾部( Guetg和Santoro,2012)。这些PTM通过不同“读者”或效应蛋白的活动调节许多细胞过程,包括基因转录,细胞分裂和DNA损伤修复(Suganuma和Workman,2011)(Musselman et al。, 2012)。因此,已经做出很大努力来识别读者的组蛋白修饰。

使用常规方法(例如,表面等离子体共振[SPR]和SPR成像[SPRi]生物传感器)研究读取蛋白与其靶蛋白PTM之间的相互作用通常需要大量底物或复杂的多步实验方法并且由于各种方法特定的限制而变得复杂。这些问题排除了量化相互作用强度的简便性和准确性(Phizicky和Fields,1995; ...

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