| Real-time Base Excision Repair Assay to Measure the Activity of the 8-oxoguanine DNA Glycosylase 1 in Isolated Mitochondria of Human Skin Fibroblasts
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) is one of the most common and mutagenic oxidative DNA damages induced by reactive oxygen species (ROS). Since ROS is mainly produced in the inner membranes of the mitochondria, these organelles and especially the mitochondrial DNA (mtDNA) contained therein are particularly affected by this damage. Insufficient elimination of 8-oxoG can lead to mutations and thus to severe mitochondrial dysfunctions. To eliminate 8-oxoG, the human body uses the enzyme 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1), which is the main antagonist to oxidative damage to DNA. However, previous work suggests that the activity of the human OGG1 (hOGG1) decreases with age, leading to an age-related accumulation of 8-oxoG. A better understanding of the exact mechanisms of hOGG1 could lead ...
[摘要] [摘要] 7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）是由活性氧（ROS）引起的最常见且诱变的氧化DN A损伤之一。由于ROS主要在线粒体的内膜中产生，因此这些细胞器，特别是其中所含的线粒体DNA（mtDNA）受到这种损害的特别影响。消除8-oxoG可能会导致突变，从而导致严重的线粒体功能障碍。为了消除8-oxoG，人体使用了8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（OGG1），它是DNA氧化损伤的主要拮抗剂。但是，先前的研究表明，人类OGG1的活性（h OGG1）随着年龄的增长而减少，导致与年龄相关的8-oxoG积累。更好地了解hOGG1的确切机制可能会导致发现新的靶标，因此对于开发预防性疗法具有重要意义。因此，我们开发了一种实时碱基切除修复测定法，该测定法采用了专门设计的双链报告寡核苷酸来测量分离的线粒体裂解物中hOGG1的活性。这里介绍的该系统与经典测定法不同，在经典测定法中，可以通过实时测量hOGG1活性通过变性丙烯酰胺凝胶进行终点测定。另外，为了确定该双功能酶的每个酶促步骤的活性（N-糖基化酶和AP-裂解酶活性），还可以进行解链曲线分析。使用各种离心步骤从人成纤维细胞中分离线粒体后，将其裂解，然后与专门设计的报告寡核苷酸一起孵育。hOGG1活性的后续测量是在常规实时PCR系统中进行的。
[背景]人体是永久的损害案例。每天约10 ...
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| Imaging of Human Cancer Cells in 3D Collagen Matrices
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Research on cell migration and interactions with the extracellular matrix (ECM) was mostly focused on 2D surfaces in the past. Many recent studies have highlighted differences in migratory behaviour of cells on 2D surfaces compared to complex cell migration modes in 3D environments. When embedded in 3D matrices, cells constantly sense the physicochemical, topological and mechanical properties of the ECM and adjust their behaviour accordingly. Changes in the stiffness of the ECM can have effects on cell morphology, differentiation and behaviour and cells can follow stiffness gradients in a process called durotaxis. Here we introduce a detailed protocol for the assembly of 3D matrices consisting of collagen I/fibronectin and embedding cells for live cell imaging. Further, we will show how ...
[摘要] [摘要]细胞迁移及其与细胞外基质（ECM）相互作用的研究最多过去专注于2D曲面。最近的许多研究都强调了与3D环境中复杂的细胞迁移模式相比，2D表面上的细胞迁移行为的差异。当嵌入3D矩阵中时，细胞会不断感知ECM的物理化学，拓扑和机械特性，并相应地调整其行为。ECM刚度的变化会影响细胞的形态，分化和行为，并且细胞会在称为durotaxis的过程中遵循刚度梯度。在这里，我们介绍了由胶原蛋白I /纤连蛋白和包埋细胞组成的3D矩阵的详细协议，用于活细胞成像。此外，我们将展示如何通过非酶糖基化来增强基质，以及用荧光染料对胶原蛋白进行染色如何使基质和细胞同时成像。该方法可用于在具有不同刚度的3D微环境中对细胞迁移进行成像，定义细胞-基质相互作用以及细胞对变化的ECM的反应，并可视化细胞的基质变形。
[背景]细胞和依赖于动态周围的细胞外基质（ECM）生成的功能性实体的调整两者的，基质和细胞，以预防疾病。多年来，人们一直认为ECM仅为嵌入式细胞提供结构支持。但是，最近的研究突出了ECM的关键功能，而不是其脚手架功能。ECM的修饰已与疾病进展相关，尤其是在癌症的背景下，与转移的发生有关，以及与临床预后和患者生存的相关性。
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| Real-time Three-dimensional Tracking of Endocytic Vesicles
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] Endocytic trafficking and recycling are fundamental cellular processes that control essential functions such as signaling protein complexes transport and membrane identity. The small GTPase Rabs are indispensable component of the endosomal recycling machinery. The Rabs bind to effectors to mediate their functions, such as protein sorting and degradation, membrane tethering or lipid modification, and organelle motility. Due to the complex and dynamic nature of endosomal compartments and tracking route, detailed multiparametric analyses of three-dimensional data by quantitative methods are challenging. Here, we describe a detailed time-lapse imaging protocol designed for the quantitative tracking of single endosomal vesicles, using GFP-Rab4-positive recycling endosomes. This method permits ...
[摘要] [摘要]内吞运输和再循环是基本的细胞过程，它们控制诸如信号蛋白复合物运输和膜特性等基本功能。小GTPase-Rabs是内质体回收机械中不可缺少的组成部分。Rabs结合效应器介导其功能，如蛋白质的分类和降解，膜栓系或脂质修饰，以及细胞器的运动。由于内体隔室和追踪路线的复杂性和动态性，用定量方法对三维数据进行详细的多参数分析是一项具有挑战性的工作。在这里，我们描述了一个详细的延时成像协议，设计用于定量跟踪单个内囊泡，使用GFP-Rab4阳性循环内体。这种方法允许在三维活体细胞成像中自动跟踪单个内吞小泡，允许研究多个参数，如丰度、速度、方向性、亚细胞定位以及蛋白质共定位。该协议可广泛应用于各种环境下的细胞模型，包括生长因子刺激、基因敲除、药物治疗等，适用于高通量筛选。
[背景] 越来越多的证据强调了在细胞迁移、粘附、形态发生、增殖、胞质分裂以及学习和记忆等不同过程中协调的内质体再循环的重要性（Grant和Donaldson，2009年；Parachoniak和Park，2012年；Wandinger Ness和Zerial，2014年；Zaoui等人，2019a和2019b）. 哺乳动物中有70多种Rab-gtpase，它们在膜转运中具有不同的定位和功能。更复杂的是，虽然大多数Rab-gtpase是普遍存在的，但有些表现出组织特异性表达（van der ...
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