| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of other putative polyamine transporters, such as isoforms of the P5B transport ATPases.
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| A Parkinson’s Disease-relevant Mitochondrial and Neuronal Morphology High-throughput Screening Assay in LUHMES Cells
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Parkinson’s disease is a devastating neurodegenerative disorder affecting 2-3% of the population over 65 years of age. There is currently no disease-modifying treatment. One of the predominant pathological features of Parkinson’s disease is mitochondrial dysfunction, and much work has aimed to identify therapeutic compounds which can restore the disrupted mitochondrial physiology. However, modelling mitochondrial dysfunction in a disease-relevant model, suitable for screening large compound libraries for ameliorative effects, represents a considerable challenge. Primary patient derived cells, SHSY-5Y cells and in vivo models of Parkinson’s disease have been utilized extensively to study the contribution of mitochondrial dysfunction in Parkinson’s. Indeed many ...
[摘要] [摘要]帕金森氏病是一种破坏性神经退行性疾病，影响65岁以上人口的2-3％。目前尚无改善疾病的治疗方法。帕金森氏病的主要病理特征之一是线粒体功能障碍，许多工作旨在鉴定可恢复破坏的线粒体生理的治疗性化合物。然而，在疾病相关模型中对线粒体功能障碍进行建模，适用于筛选大型化合物文库的改善作用，这是一个巨大的挑战。病人原代细胞，SHSY-5Y细胞和体内 帕金森氏病模型被广泛用于研究线粒体功能障碍在帕金森氏症中的作用。确实，许多研究已经利用LUHMES细胞研究帕金森氏病，但是，尽管与其他常用模型相比，LUHMES细胞与其他常用模型相比具有多种优势，例如快速分化和高均一性，但以前并未用作PD相关的线粒体功能障碍的复合筛选模型。 （例如，与来自iPSC的神经元相反），以及与人类中脑组织相关的生理学，能够分化为高度表达特征性标记的多巴胺能样神经元。在先前产生GFP + -LUHMES细胞以模拟代谢功能障碍后，我们报道了在PD相关的线粒体功能障碍恢复模型中使用GFP + -LUHMES细胞进行高通量化合物筛选的方案。该协议描述了通过评估一系列线粒体和神经元形态学参数，使用强大且可重现的毒素诱导的GFP + -LUHMES细胞模型进行高通量化合物筛选的方法。我们还提供了有关数据和统计分析的详细说明，包括Z'得分的示例计算，以评估独立实验中的统计效应大小。
[背景]帕金森氏病（PD）是一种神经退行性疾病，其主要特征是中脑黑质中多巴胺能神经元的丢失以及神经元内包涵体中α-突触核蛋白的积累。它是第二种最常见的神经退行性疾病，影响65岁以上人口中2-3％的人口（Poewe ...
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| Protocol for Isolation, Stimulation and Functional Profiling of Primary and iPSC-derived Human NK Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Natural killer (NK) cells are innate immune cells, characterized by their cytotoxic capacity, and chemokine and cytokine secretion upon activation. Human NK cells are identified by CD56 expression. Circulating NK cells can be further subdivided into the CD56bright (~10%) and CD56dim NK cell subsets (~90%). NK cell-like cells can also be derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). To study the chemokine and cytokine secretion profile of the distinct heterogenous NK cell subsets, intracellular flow cytometry staining can be performed. However, this assay is challenging when the starting material is limited. Alternatively, NK cell subsets can be enriched, sorted, stimulated, and functionally profiled by measuring secreted effector molecules in the supernatant by Luminex. Here, ...
[摘要] [摘要]天然杀伤（NK）细胞是先天性免疫细胞，其特征在于其细胞毒性能力以及活化后的趋化因子和细胞因子分泌。人NK细胞通过CD56表达鉴定。循环的NK细胞可进一步细分为CD56亮（约10％）和CD56暗NK细胞亚群（约90％）。NK细胞样细胞也可以源自人诱导的多能干细胞（iPSC）。为了研究不同的异源NK细胞亚群的趋化因子和细胞因子分泌概况，可以进行细胞内流式细胞仪染色。然而，当起始原料有限时，该测定法具有挑战性。或者，可以通过Luminex测量上清液中分泌的效应子分子来富集，分选，刺激和功能性分析NK细胞亚群。在这里，我们提供了一种快速直接的方案，用于分离和刺激原代NK细胞或iPSC衍生的NK细胞样细胞，并随后检测分泌的细胞因子和趋化因子，这也适用于少量细胞。
[背景]自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统的一部分，提供第一线防御病毒感染和畸形。在人血中，可以基于CD56和CD16表达鉴定出两个不同的NK细胞群体：CD56明亮的CD16 +/-和CD56暗的CD16 + ...
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