| Trypanosomatid, fluorescence-based in vitro U-insertion/U-deletion RNA-editing (FIDE)
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Gene expression within the mitochondria of African trypanosomes and other protozoan organisms relies on a nucleotide-specific RNA-editing reaction. In the process exclusively uridine (U)-nucleotides are site-specifically inserted into and deleted from sequence-deficient primary transcripts to convert them into translatable mRNAs. The reaction is catalyzed by a 0.8 MDa multiprotein complex termed the editosome. Here we describe an improved in vitro test to quantitatively explore the catalytic activity of the editosome. The assay uses synthetic, fluorophore-derivatized oligoribonucleotides as editing substrates, which enable the automated electrophoretic separation of the reaction products by capillary electrophoresis (CE) coupled to laser-induced fluorescence (LIF) detection systems. The ...
[摘要] [摘要]非洲锥虫和其他原生动物生物线粒体内的基因表达依赖于核苷酸特异性的RNA编辑反应。在该过程中，仅将尿苷（U）-核苷酸位点特异性插入序列不足的初级转录物中，并从中缺失，以将其转化为可翻译的mRNA。该反应由0.8 MDa的多蛋白复合物催化，该复合物被称为编辑体。在这里我们描述了一种改进的体外试验，以定量探索Editosome的催化活性。该测定使用合成的，荧光团衍生的寡核糖核苷酸 作为编辑底物，可通过耦合到激光诱导荧光（LIF）检测系统的毛细管电泳（CE）自动分离反应产物。该测定法功能强大，只需要纳克级的材料，并且通过使用多毛细管CE / LIF仪器，可以高度平行的方式进行测定。进一步的改进包括使用硫代磷酸酯修饰的，因此具有RNase耐性的底物RNA，以及用于同时监测U插入和U缺失反应的多重型荧光团标记策略。该测定方法对于研究酶体的机理和酶学是有用的。ħ H但是，它也可以在高通量执行以筛选RNA编辑特异性抑制剂。
图形摘要：
基于荧光的体外U插入/ U缺失RNA编辑（FIDE）分析的特征
[背景]中的RNA编辑反应动质体原生动物如非洲锥虫和利什曼原虫表示一个信使的最显着的转录后修饰（米）的RNA（综述Göringer ...
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| Site-specific Labeling of B Cell Receptor and Soluble Immunoglobulin
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] B lymphocyte activation is regulated by its membrane-bound B cell receptors (BCRs) upon recognizing diverse antigens. It is hypothesized that antigen binding would trigger conformational changes within BCRs, followed by a series of downstream signaling activation. To measure the BCR conformational changes in live cells, a fluorescent site-specific labeling technique is preferred. Genetically encoded fluorescent tags visualize the location of the target proteins. However, these fluorescent proteins are large (~30 kDa) and would potentially perturb the conformation of BCRs. Here, we describe the general procedures of utilizing short tag-based site-specific labeling methodologies combining with fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay to monitor the conformational changes within ...
[摘要] [摘要 ] 识别各种抗原后，B淋巴细胞的活化受其膜结合B细胞受体（BCR）的调节。假设抗原结合将触发BCR内的构象变化，随后引发一系列下游信号激活。为了测量活细胞中的BCR构象变化，首选荧光位点特异性标记技术。遗传编码的荧光标签可视化目标蛋白的位置。但是，这些荧光蛋白很大（〜30 k Da ），可能会干扰BCR的构象。在这里，我们描述了利用基于短标签的位点特异性标记方法与荧光共振能量转移（FRET）分析相结合来监视BCR细胞外域内抗原结合时构象变化的一般程序。
[背景 ] B淋巴细胞是负责产生针对病理从识别由细胞膜抗原所产生的保护性抗体的表达的B细胞受体（BCRS）。BCR复合物包含膜结合免疫球蛋白（mIg ）和Igα和Igβ的非共价连接的异二聚体。所述mIg的由两个替代轻链和两个免疫球蛋白重链。所述mIg的重链含有胞外结构域，跨膜结构域，和细胞内结构域。在胞外mIg 的N-末端结构域，有两个可变的抗原结合基序，其后是恒定结构域（Reth，1992）。就IgM-BCR的重链而言，它包含4个域，即Cμ1，Cμ2，Cμ3和Cμ4（图1）。重链和轻链多肽中的结构可变域形成了抗体特有的抗原结合位点。例如，VRC01广泛中和抗体（bnAbs ...
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