| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as well novel topoisomerase 1 (TOP1) interacting proteins. In this protocol, we first extracted nuclear proteins by sequentially increasing detergent and salt concentrations, the extracted fractions were ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
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| A Method to Efficiently Cryopreserve Mammalian Cells on Paper Platforms
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] This protocol describes a simple method to cryopreserve mammalian cells within filter papers as an alternative to conventional slow-freezing approach. The method involves treating paper fibers with fibronectin, using low concentrations of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide (DMSO), and slow freezing cells to -80 °C at a 1 °C min-1 rate. In our method, the biocompatibility, large surface area, 3D porosity and fiber flexibility of the paper, in combination with the fibronectin treatment, yield recovery of cells comparable to conventional approaches, with no additional fine-tuning to freezing and thawing procedures. We expect that the paper-based cryopreservation method will bring several advantages to the field of preserving mammalian cells, including accommodation of a higher ...
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种简单的方法，可在滤纸中冷冻保存哺乳动物细胞，以替代常规的慢速冷冻方法。该方法包括使用纤连蛋白处理纸纤维，使用低浓度的冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），然后以1°C min -1的速率将细胞缓慢冷冻至-80°C 。在我们的方法中，纸的生物相容性，大表面积，3D孔隙率和纤维柔韧性与纤连蛋白处理相结合，可产生与传统方法相当的细胞回收率，而无需对冷冻和解冻程序进行额外的微调。我们期望纸质冷冻保存方法这将为保存哺乳动物细胞领域带来几项优势，包括在单位体积内容纳更多数量的细胞，并且释放后无细胞损失。该方法需要最小的存储空间，在该存储空间中，可以将具有大面积的纸平台卷起和/或折叠并存储在库存中，并允许按需方式有效地运输/分配细胞。此外，该方法的另一个特征包括细胞球体和3D细胞培养物的形成和冷冻保存。
[背景] 哺乳动物细胞的成功保存，长期保存，维护和分配是重要的研究领域，目前仍在深入的科学研究中。特别是，冷冻细胞的及时稳定供应与组织工程研究有关，例如细胞培养，药物开发和测试以及再生和生物治疗医学。
当前的常规细胞冷冻保存方案包括缓慢和快速的冷冻和玻璃化（Pegg，2002； Baust 等，2009）。在这些方法中，将各种浓度的冷冻保护剂添加到细胞悬浮液中，然后以低至1°C min -1 ...
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