| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
|
|
Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as well novel topoisomerase 1 (TOP1) interacting proteins. In this protocol, we first extracted nuclear proteins by sequentially increasing detergent and salt concentrations, the extracted fractions were ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
|
|
|
| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
|
|
|